香蕉MaMYBR1基因的克隆和表达分析

为研究MaMYBR1基因参与香蕉响应的胁迫过程,本研究利用RT-PCR获得香蕉MaMYBR1基因的全长,包含786个核苷酸,编码261个氨基酸。将该基因核苷酸序列在NCBI进行BLASTn比对,发现该基因与大麦(AK359880)、花药野生稻(XM_015836768.1)和小麦(AB252147.1)的基因序列具有较高的相似度,相似度分别为80.06%、79.19%和79.19%。蛋白结构域分析发现该基因编码的蛋白质序列包含有一个MYB结构域和一个SANT结构域。系统进化树分析表明,该蛋白与海枣(XP_008785342.1)和油棕(XP_010920477.1)等植物亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR分析表明MaMYBR1以上调表达模式参与香蕉响应低温、干旱和盐等胁迫过程,其中在低温胁迫下MaMYBR1基因的相对表达量变化最大;MaMYBR1基因在接种枯萎病菌的抗病品种中显著上调表达,而在感病品种中显著下调表达,MaMYBR1基因可能参与香蕉抗枯萎病过程。因此,本研究将为后续香蕉遗传改良提供有价值的研究信息。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

两个谷子CIPK基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出2个CIPK基因, 命名为SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因组序列长1994 bp,编码451个氨基酸;SiCIPK16基因组序列长1885 bp,编码473个氨基酸,2个基因均无内含子和可变剪切。生物信息学分析显示这2个基因在蛋白质序列和结构上与其他物种CIPK基因一样非常保守。实时定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有所上调, SiCIPK6基因在ABA、干旱和盐处理时表达量上调幅度较大,而SiCIPK16基因在低温、干旱和高温处理时表达量上调幅度较大。半定量PCR检测结果表明SiCIPK6和SiCIPK16两个基因在拔节、孕穗、灌浆期时均有表达,在相应生育时期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高。推测SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。     

香蕉MabZIP53基因的克隆和表达分析

bZIP转录因子在植物的生长发育和响应胁迫的过程中起重要作用。本研究利用全长均一化cDNA文库获得一条全长438 bp cDNA序列,与香蕉基因组数据库比对之后,将其命名为MabZIP53,编码145个氨基酸,预测分子量为35.24 kD,等电点为5.22,其编码的蛋白定位于细胞核。系统发育分析表明MabZIP53与凤梨(XP_020114228.1)、大叶藻(KMZ62676.1)的亲缘关系较近。MabZIP53在不同非生物胁迫(低温,干旱,盐)下均上调表达,尤其干旱胁迫下相对表达量最为显著。在接种Foc TR4后,抗病品种‘GCTCV-119’中MabZIP53表达量显著上调,而感病品种巴西蕉中MabZIP53表达量下调表达。这些研究结果表明MabZIP53可能参与香蕉响应生物胁迫和非生物胁迫的过程,为香蕉的遗传改良提供理论基础。     

玉米分子伴侣基因ZmBiP2在逆境下的功能分析

BiP(binding protein)基因编码的蛋白是一类重要的分子伴侣,在动植物的逆境胁迫响应过程中具有重要的作用。从玉米抗旱自交系旱21中分离到分子伴侣基因ZmBiP2,序列分析结果显示,该基因开放阅读框长1989 bp,编码含663个氨基酸的蛋白,包含热激蛋白家族特有的TVIGIDLGTTYSC保守结构域和ATP结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Zm Bi P2基因在玉米的雄穗和子房中表达量最高;在盐、甘露醇胁迫条件下,该基因在植株的地上部分上调表达。过量表达Zm Bi P2基因的拟南芥转基因株系在种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,在苗期对盐胁迫敏感。推测在植物响应非生物胁迫的过程中,过量表达的ZmBiP2蛋白可能发挥负调节蛋白的功能。     

茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

扁桃AcCBF2基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

本研究根据扁桃生物信息学数据库,采用PCR的方法从扁桃(Amygdalus communis L.)中克隆了一个CBF转录因子基因,命名AcCBF2,基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为717 bp,编码238个氨基酸,预测其分子量26.59 kD,等电点为5.29。氨基酸多重序列比对显示,AcCBF2基因编码的氨基酸与其它植物冷胁迫相关的CBF氨基酸序列具有高度同源性,含有一个AP2功能结构域和2个特征基序;系统发育树分析显示,AcCBF2基因属于DREB家族中的A-1亚族,荧光定量显示,AcCBF2基因只对低温和干旱胁迫有响应,对盐胁迫和ABA(脱落酸)没有明显响应。在低温胁迫下,表达量上调;而在干旱胁迫下,表达量先上调后下调。初步预测AcCBF2基因可能对扁桃非生物胁迫有重要的调控作用。     

红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥

WRKY转录因子在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。本研究根据红麻转录组unigene序列(CL3883.Contig4),设计引物进行PCR扩增,经sanger测序获得全长为957 bp的HcWRKY71基因cDNA序列。该基因开放读码框为957 bp,编码1个含有318个氨基酸的蛋白,具有1个WRKY功能保守结构域,属于II类WRKY转录因子。在盐胁迫下,HcWRKY71基因表达量随NaCl溶液浓度升高而增加;在干旱胁迫下,HcWRKY71基因表达量随干旱胁迫时间的增加呈现先下降再上升然后再下降的趋势;在重金属镉胁迫下,HcWRKY71基因表达量随CdCl2溶液浓度的增加而降低。表明该基因表达受盐、干旱和重金属镉胁迫的诱导。利用农杆菌介导花序浸染法将该基因转化拟南芥发现,HcWRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性,这为进一步研究HcWRKY71基因的耐逆机制奠定了坚实的基础。     

水曲柳WRKY40基因的克隆及表达模式分析

从水曲柳中克隆一个WRKY基因,序列比对后命名为Fm WRKY40,基因编码区全长为936 bp,编码331个氨基酸(GenBank登录号:KU928310);含有一个WRKY保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅱ类成员;分子进化分析表明,Fm WRKY40与芝麻WRKY40亲缘关系最近,蛋白相似性为73%;qRT-PCR表达模式分析表明:Fm WRKY40在干旱胁迫和ABA(脱落酸)胁迫下明显上调表达,该基因在水曲柳应答干旱和其他非生物胁迫中可能起重要的调控作用。     

玉米ZmCIPK20基因克隆及表达分析

CIPK蛋白激酶是植物非生物胁迫信号传导途径中的重要元件。为克隆玉米CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20全长c DNA序列,并分析其在盐胁迫下的表达模式,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的序列进行分析,采用荧光定量PCR方法研究ZmCIPK20在盐胁迫下的表达。本研究从玉米中克隆了一个编码CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20,该基因c DNA全长1 800 bp,5'-非编码区长203 bp,3'-非编码区长202 bp,编码区长1 395 bp,编码464个氨基酸,预测分子量为50.993 kD,等电点为8.55。推测的氨基酸序列中含有1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和1个NAF结构域。进化树分析发现,ZmCIPK20和SbCIPK分为一个分支。荧光定量PCR检测表明,ZmCIPK20基因受盐胁迫诱导表达,在根中下调表达,在叶中上调表达,说明玉米ZmCIPK20基因可能参与玉米对盐胁迫的应答,为揭示该基因的生物学功能提供依据。     

小麦小G蛋白Rab2基因TaRab2的克隆及其表达分析

小G蛋白Rab在真核细胞内的小泡运转过程中起重要作用。本文通过反向Northern筛选,从小麦抗旱品种旱选10 号水分胁迫诱导表达的cDNA文库中分离到与小G蛋白Rab2基因高度同源的EST片段。利用电子克隆和RT-PCR方法,在小麦中克隆了该基因的全长cDNA,命名为TaRab2（GenBank编号为AY851657）。测序结果表明,TaRab2的cDNA长度为824 bp,包含一个完整的633 bp的ORF,推测编码一个210个氨基酸的蛋白质。氨基酸多重比对分析表明,TaRab2编码的蛋白质与玉米、水稻、拟南芥及Sporobolus stapfianus等植物小G蛋白Rab2的同源性均大于90%。Northern杂交分析结果表明,TaRab2为水分胁迫诱导上调表达的基因,在水分胁迫6 h的表达量最高,随着胁迫时间的推移表达量下降。     

红麻海藻糖生物合成关键酶基因HcTPPJ的克隆及响应逆境的表达分析

Trehalose biosynthesis key enzyme gene TPP plays an important role in plant response to various abiotic stresses. In this study, in order to clarify the role of TPP gene in response to abiotic stress in kenaf, a specific primer was designed according to the sequence of CL541.contig2unigene, and the full-length cDNA sequence of TPP gene was obtained by PCR. Bioinformatics analysis showed that TPP had an open reading frame (ORF) length of 1128 bp, and encoded a protein containing 375 amino acids. The results of amino acid sequence consistency indicated that the agreement between the amino acid sequence of protein and that of TPPJ from other species was 71.18%, so the gene named as HcTPPJ. HcTPPJ was expressed in roots, stems and leaves. Under salt or drought stress, HcTPPJ was up-regulated significantly with the extension of stress treatment, indicating that the gene was involved in the response process of salt or drought stress in kenaf. Under the same conditions, HcNCED3 and HcAOC was significantly up-regulated, while the change of HcTPPJ expression was not obvious under ABA stress; HcTPPJ was significantly down-regulated, under the stress of MeJA for six hours. Therefore it was speculated that the HcTPPJ gene expression may be not regulated by the signal molecule of ABA, but negatively regulated by methyl jasmonate signal molecule. This study will lay a solid foundation for further elucidating the role of the gene in response to salt and drought stress in kenaf.     

香蕉过氧化物酶基因表达和酶活性与香蕉抗枯萎病的关系

为了获得能反应香蕉遭受枯萎病侵染的标记基因。通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得一个过氧化物酶基因,命名为MaPOD1（GenBank登录号为KC478598）。扩增获得的cDNA序列与质粒序列一致,表明该基因是香蕉POD基因编码框全长cDNA,包含一个948 bp的最大开放阅读框,编码一个长328个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有过氧化物酶活性位点和亚铁血红素配体位点结构。实时荧光定量PCR分析表明该基因在香蕉根和假茎中表达量较高;在球茎中的表达量最低。在耐病和感病品种中,MaPOD1均上调表达,但在耐病品种中MaPOD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明在该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。该基因的表达与酶活变化趋势相同,基因表达滞后于酶活变化。MaPOD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

花生AhSOS2基因的克隆及功能初探

SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属SOS2类基因, 被命名为AhSOS2(GenBank登录号为HG797656), 编码446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示, AhSOS2在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L^-1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达, 表达量约是对照茎中的30倍; 而在30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综合以上结果, 显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了AhSOS2的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及品质改良具有重要意义。     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

苹果MdSBP20基因抗非生物胁迫的研究

为获得苹果砧木逆境胁迫相关转录因子,以QZ1(平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)×柱型苹果株系CO(Malus domestica Borkh.)和M26为试材,利用同源克隆法克隆得到苹果SBP基因cDNA的全长序列,命名为MdSBP20。对扩增得到的cDNA序列进行生物信息学分析,结果表明,该序列全长1 362 bp,包含完整开放阅读框1 362 bp,编码454个氨基酸,具有明显的SBP结构域,包含2个锌指结构Zn-1、Zn-2和双向核定位信号区NLS。系统进化树分析,结果表明MdSBP20与白梨(XM_009339726.1)和苹果(XM_008376435.1)亲缘关系较近。实时荧光定量分析结果表明,MdSBP20基因在低温、干旱、盐害中发挥一定功能,推测QZ1的耐寒性、耐旱性及耐盐性均强于M26。研究表明,MdSBP20基因在苹果响应非生物逆境胁迫中具有重要调控作用。     

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因.该基因cDNA全长1328 bp,包括1008bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35911.03Da,极性氨基酸占29.12%.序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远.