鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了一对可扩增N基因片段的引物,并得到了预期的438 bp长的扩增产物;将目的条带纯化并回收以后,克隆到pMD18-T质粒载体中,对插入片段进行序列测定,并与已发表的IBV N基因序列进行了比较和分析,证明扩增产物是正确的,从而建立起了一种准确、实用的检测、鉴定IBV方法.     

鸡体内传染性支气管炎病毒的分布及消长

对两周龄SPF鸡用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株攻击时,以0．3ml／羽(100EID50)滴鼻人工感染发病,试验鸡出现气管哆音等典型的IBV临床症状,以及气管、肺、肾脏等器官的组织学病变。经nested RT-PCR全程跟踪检测,掌握了IBV M41株经呼吸道感染后动物带毒、排毒的时间规律,从而为控制和降低IB的发生提供参考。     

鸡传染性支气管炎病毒W株膜蛋白基因的分子特征

【目的】研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)W株膜蛋白基因的分子特征。【方法】根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒M基因序列,设计并合成1对特异性引物,利用RT-PCR技术成功扩增了IBV河南地方分离毒株W株M基因全长片段,然后进行克隆、测序,并与GenBank中发表的11株国内外参考毒株进行比较分析。【结果】获得的W株M基因全长为681 bp,编码M蛋白226个氨基酸残基,其N端的前60 nt为前导序列,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点;3个跨膜区域分别位于21~37,45~68,74~94 aa处,在171~176,183~193 aa处有2个潜在的抗原位点,且M蛋白上有9个高度保守的半胱氨酸;与参考毒株相比,IBV-W株M基因的核苷酸同源性为88.2%~92.7%,推导的氨基酸同源性为91.1%~95.6%;M蛋白的突变主要发生在前16位氨基酸,其中第2位缺失1个氨基酸,第3~6位连续插入4个氨基酸,第8~9位缺失2个氨基酸,第14~16位的3个氨基酸发生连续突变,其他位点的氨基酸变异为点突变,M蛋白核苷酸序列的变异主要表现为静默突变,亲水区较疏水区更易变易;在系统发生进化树中,W株与BJ株处于同一个小的分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株的亲缘关系较远。【结论】推测W株可能是一个新的变异株。     

鸡传染性支气管炎病毒N基因的克隆及序列分析

根据GenBank上已公布的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列经多重比较设计一对特异性引物扩增大庆分离株DQ1株的N基因,RT-PCR产物经纯化回收后,克隆到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,筛选出阳性质粒进行序列测定,经与已发表的IBV N基因序列进行序列比较与分析,表明DQ1株的N基因与现有疫苗株存在一定差异.     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株的形态观察和S1基因的RT-PCR扩增

参照已发表的IBVBeaudette株全基因组序列 ,自行设计合成了 3条引物 (youl 、you2 -、youM ) ,引物you1 和you2 -在S1基因两侧 ,跨幅约 16 10bp ,引物you2 -和youM 在S1基因的 3’端 ,跨幅约 5 30bp。用这两对引物对 5个IBV地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC1)进行RT -PCR ,均成功地扩增出相应大小的目的片段。病毒在电镜下观察可见到形态多变的冠状病毒粒子     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒（IBV）N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株（GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728）后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎（ILTV）、禽偏肺病毒（a MPV）、传染性法氏囊病（IBDV）、禽白血病病毒（ALV）及马立克氏病毒（MD...     

鸡传染性支气管炎病毒上海地方分离株的RT-PCR快速检测

根据已报道的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)基因序列设计了 1对可用于扩增不同病毒株N基因片段的引物 ,得到了预期的 438bp长的产物 ,并将此RT PCR方法与鸡胚盲传法结合用于分离、检测IBV。分离病毒的扩增条带经纯化和回收以后 ,克隆到pMD18 T质粒载体中。在对插入片段进行序列测定后 ,我们将测序结果与已发表的IBVN基因序列进行了比较 ,证实具有极高的同源性 ,表明分离的是IBV。据此建立起一种更加快速、有效的分离、鉴定IBV的方法。     

传染性支气管炎病毒NP基因在大肠杆菌中的可溶性表达

[目的]生产具有生物活性的、可用于临床检测的NP融合蛋白抗原,建立可用于临床检测IB抗体诊断的试剂盒。[方法]利用RT-PCR技术扩增传染性支气管炎病毒M41株的NP基因,将之克隆并重组于原核表达载体pET-28a,经PCR、酶切鉴定及序列分析构建重组表达载体pET-NP,研究NP基因在大肠杆菌中的可溶性表达。[结果]将重组载体pET-NP转化表达菌BL21,获得阳性重组菌pET-NP-BL。阳性重组子经IPTG诱导后,目的基因NP获得了高效表达。表达产物经过SDS-PAGE与Western blot检测表明,NP分子量约为49 kD,且以可溶性蛋白形式存在;表达产物可与特异性传染性支气管炎病毒抗血清发生免疫反应。表达产物可以用作检测IB抗体的抗原。[结论]该融合蛋白可用于生产检测IB的诊断试剂,生物安全性高,生产方便。但尚需建立适当的检测方法,进一步研究其实际诊断价值。同时也可以研制新型IB重组亚单位疫苗,进一步研究其刺激动物机体产生的细胞与体液免疫,深入研究新功能,筛选新的抗原表位,为生产新型IB基因工程疫苗奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列,针对IBVM基因全序列设计合成了一对引物,以IBV疫苗株为模板,建立了检测IBV的RT-PCR方法.应用该方法对IBV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1105 bp的特异性目的片段;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的IBV-M-cDNA.结果表明建立的RT-PCR方法对IBV的检测敏感性高、特异性强,可用于IBV感染的诊断和流行病学调查.     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测

鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性略高于与其他毒株的反应性。以上结果表明,原核表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望作为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断。     

传染性支气管炎病毒地方分离毒株S1基因的RT-PCR方法研究

以传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）标准毒株Ｍ４１为材料,根据Ｇｅｎｂａｎｋ公开序列自行全成一对特异引物,用于扩增ＩＢＶ的完整Ｓ１基因。建立了针对ＩＢＶ基因组ＲＮＡ特点的ＲＴ－ＰＣＲ方法。对反应体系中的重要反应物Ｍｇ＾２＋、ｄＮＴＰ和引物浓度进行优化,确定其浓度值分别为１．５ｍｍｏｌ／Ｌ,２００μｍｏｌ／Ｌ和４０μｍｏｌ／Ｌ。使用此反应体系对国内ＩＢＶ地方离毒株ＪＳ／９５／０３,ＳＤ／９７／０１等１０多     

鸡传染性支气管炎病毒上海地方分离株的RT—PCR快速检测

根据已报道的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）基因序列设计了1对可用于扩增不同病毒株N基因片段的引物，得到了预期的438bp长的产物，并将此RT－PCR方法与鸡胚盲传法结合用于分离、检测IBV。分离病毒的扩增条带经纯化和回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中。在对插入片段进行序列测定后，我们将测序结果与已发表的IBV N基因序列进行了比较，证实具有极高的同源性，表明分离的是IBV。据此建立起一种更加快速、有效的分离、鉴定IBV的方法。     

IBV S1基因RT—PCR产物的分子克隆

报道了在两条引物的５‘端加有不同酶切位点的ＩＢＶ Ｄ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物与ｐＵＣ１８进行分子克隆的研究情况。采用自己改进的微量基因克隆的方法，经回收的插入片段的分子量大小及ＨａｅⅢ酶切分析，证明获得了两株重组质粒转化子。     

IBVS1基因RT－PCR产物的分子克隆

报道了在两条引物的５′端加有不同酶切位点的ＩＢＶＤ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物与ｐＵＣ１８进行分子克隆的研究情况。采用自己改进的微量基因克隆的方法，经回收的插入片段的分子量大小及ＨａｅⅢ酶切分析，证明获得了两株重组质粒转化子     

人骨形成蛋白3基因cDNA部分序列的RT-PCR克隆

针对人骨形成蛋白 3基因的 c DNA序列设计引物 ,通过反转录 PCR技术 ,从人骨纤维肉瘤组织中扩增出目的片段。从胶中回收目的片段 ,将其与 p MD18- T载体连接 ,转化大肠杆菌 DH 5α后 ,经 H ind 酶切鉴定 ,进行测序。结果显示所得到的片段大小为 84 5 bp,与所设计的序列同源性为 10 0 % ,说明已经成功地扩增、克隆了人骨形成蛋白 3(h BMP- 3)基因 c DNA的大部分序列。     

鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物。经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的条带纯化并回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中，对插入片段进行序列测定。并与已发表的IBV S1、N基因序列进行了比较和分析，表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBV S1和N结构蛋白基因。     

中国禽肾病变IBV分离株S1基因的RT-PCR/RFLP特性

对中国１３个省市分离到的２９个肾病变ＩＢＶ毒株作了Ｓ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ／ＲＦＬＰ特性鉴定．用相同的一对引物,８个毒株———广东／０１／８３,河南／０４／９４,河南／０５／９４,内蒙／０１／９３,江苏／０１／９３,河南／０１／９３,天津／０２／９３,内蒙／０２／９３,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得了包含有Ｓ１基因ｃＤＮＡ的１７３４ｂｐ的片段;河南／０６／９５的为一１０００ｂｐ左右的片段;其它２０个毒株没有结果．经ＲＦＬＰ分析,广东／０１／８３,河南／０４／９４,河南／０５／９４,内蒙／０１／９３归类于Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｓ血清型,江苏／０１／９３归于Ｇｒａｙ血清型,河南／０１／９３,天津／０２／９３,内蒙／０２／９３是新的变异株．研究结果表明,国内禽肾病变ＩＢ的致病毒株,在不同的地区有其特异的变异株,也有一个共同的血清型———Ｍａｓａｃｈｕｓｅｔｓ型的毒株     

IBV陕西分离株M基因的克隆与遗传变异分析

为了研究IBV陕西分离株M基因的遗传变异情况及分子特征,参照NCBI所登录的IBVM基因序列设计了1对引物,应用RT-PCR方法对陕西8株IBV分离株的M基因进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析,并对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明,8个IBV分离株间的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸同源性分别为92.3%~99.8%和95.4%~100%,分离毒株与参考毒株的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸序列同源性分别为87.4%~99.5%和89.4%~99.5%;分离毒株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100氨基酸肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构;分离毒株的M蛋白均包含有3个跨膜区。表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。