稻瘟病菌MGG14093基因功能的初步研究

根据之前的基因芯片分析,发现在稻瘟病菌侵染水稻的过程中,许多基因被诱导表达。MGG14093为其中一个推测为编码分泌蛋白的未知功能基因,在病菌侵染过程中该基因表达量上调2.906。利用生物信息学在线软件对该基因编码蛋白的特性进行初步分析,并通过RT-PCR扩增进一步分析该基因在稻瘟病菌侵染水稻过程中的表达动态,利用基因敲除和过量表达技术对该基因的功能进行初步研究。结果表明:该基因编码蛋白为定位于胞外的分泌蛋白,没有已知的蛋白结构域,但可能存在几处氨基酸活性位点。MGG14093基因敲除和过量表达后,对稻瘟病菌的营养生长、产孢及附着胞分化没有显著的影响,但该基因过量表达后导致病菌的致病力下降,表明该基因可能参与病菌的致病过程。本研究结果为进一步揭示MGG14093基因的生物学功能奠定了基础。     

稻瘟病菌类LxAR家族基因的预测及表达分析

在侵染水稻过程中,稻瘟病菌分泌一系列效应因子来抑制寄主免疫系统。无毒效应因子AVR Pii和AvrPiz-t的氨基酸序列含有类LxAR基序,基于此,本研究利用生物信息学技术,从稻瘟病菌基因组中筛选获得了99个含有类LxAR基序的假定效应因子(MoLLEs)。该家族蛋白都为小分子蛋白(70~300 aa),富含半胱氨酸氨基,绝大多数为未知功能的蛋白。24个蛋白含已知的功能域,可能涉及了多种生命过程,其中有9个蛋白编码植物细胞壁降解酶。通过表达模式分析发现,MoLLEs家族基因成员的表达受到饥饿胁迫、附着胞生长发育以及侵染水稻等过程的诱导,此外一部分基因受到附着胞发育关键基因PMK1调控。基因表达交叉分析表明,部分基因同时在附着胞发育和致病过程中上调表达。在与水稻的相互作用中,MoLLEs在稻瘟病菌侵染不同阶段均有上调表达,并且部分基因受亲和或非亲和反应特异性诱导。      

水稻抗稻瘟病菌防卫反应的细胞学分析与防卫基因表达

对水稻类病变坏死突变体 lmm1　(LmmKaty)与原亲本及双单倍体YT14和YT16接种稻瘟病菌24 h内的抗病反应、细胞学和分子作用机理进行了研究。人工接种实验表明,与原亲本相比,该突变体对稻瘟病菌具有更强的抗性。突变体接种20~24 h后,自动荧光检测到细胞死亡,而对照则未检测到。表明该突变体通过细胞程序性死亡阻止稻瘟病菌的蔓延,从而提高了抗病性。Northern blotting结果发现,抗病品系YT14中的防卫相关基因、苯丙氨酸解氨酶基因和β 葡聚糖酶基因在人工接种稻瘟病菌6 h后开始表达,16~24 h后上述基因表达量快速增加;而病程相关蛋白基因 PR 1和几丁质酶基因在人工接种稻瘟病菌24 h后才开始表达。与YT14相比,感病品系中上述基因的表达明显延迟。表明在人工接种稻瘟病菌24 h内水稻可启动抗病防卫反应,从而对稻瘟病菌产生抗性。     

水稻泛素结合酶基因家族的生物信息学与表达分析

泛素/蛋白酶体系统在植物的生长发育、形态建成和抗病反应等过程中起着重要的作用。近年的研究表明,某些病原菌能够模拟寄主植物泛素/蛋白酶体系统组分,从而达到利用该系统为病原菌服务的目的。泛素结合酶是泛素化反应过程中的第二个酶,对植物泛素/蛋白酶体系统的正常运行不可或缺。已有的研究表明,水稻基因组数据库中存在48个预测的泛素结合酶基因。为了初步揭示这些泛素结合酶基因在植物抗病防御反应中的功能,研究其与植物抗病性的关系。本研究通过生物信息学、RNA-seq和qRT-PCR的方法,分析了水稻泛素结合酶基因家族的特征及其表达模式。系统进化树分析表明,48个水稻泛素结合酶基因可分为3个大组,总共7个亚组。蛋白结构域分析表明,水稻泛素结合酶基因主要由一个泛素结合酶催化结构域组成。电子表达谱分析表明,大多数水稻泛素结合酶基因能被稻瘟病菌诱导表达。启动子区顺式作用元件分析表明,4个抗病相关顺式作用元件和1个过敏性反应相关顺式作用元件在48个水稻泛素结合酶基因的启动子区有很高的分布。稻瘟病菌接种亲和性和非亲和性水稻单基因系的RNA-seq结果表明,处理36h读取到的水稻泛素结合酶基因为44个,其中高表达基因数量超过读取到的泛素结合酶基因总数的50%。qRT-PCR分析结果表明稻瘟病菌的侵染在亲和和非亲和组合中都能诱导部分水稻泛素结合酶基因的表达。在非亲和组合中水稻泛素结合酶基因的表达倾向于受到抑制。     

转小萝卜γ-硫堇蛋白基因RsAFP1水稻的获得及其稻瘟病抗性初步鉴定

将从小萝卜中分离的硫堇蛋白类基因RsAFP1通过基因工程的方法导入带有泛素Ubiquitin启动子及抗除草剂Bar基因的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导对圣稻13进行遗传转化。对获得的阳性转基因植株进行稻瘟病菌体外及室内苗期稻瘟病菌接种抗性鉴定,结合田间自然发病情况,对转基因植株的抗稻瘟病性进行综合评价。初步结果表明,外源RsAFP1基因的导入可在一定程度上提高水稻对稻瘟病的抗性。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

稻瘟病菌一个假想几丁质酶的表达分析

为研究稻瘟病菌几丁质酶在稻瘟病菌形态建成和致病过程中的作用,对稻瘟病菌MGG_08054.6编码的一个假想几丁质酶进行生物信息学分析、基因表达及其融合蛋白分泌特性研究.结果显示:稻瘟病菌基因MGG_08054.6编码的蛋白MoChil与里氏木霉、桔绿木霉、烟曲霉、禾布氏白粉菌已知的18家族几丁质酶(EC 3.2.1.14)蛋白序列同源性大于40%,并具有几丁质酶催化区域的两个保守基序GGW和DG-D-DWE及部分几丁质结合区的活性位点,该蛋白序列经程序SignalP 3.0分析含有信号肽,在16T-17S和26Q-27S处有两个可能的剪切位点;将MGG 08054.6基因在稻瘟病菌Guy11进行过量表达,获得分泌蛋白,证明了该蛋白的分泌特性.半定量RT-PCR分析表明,该基因在不同生长发育阶段及侵染水稻阶段均有表达,其中菌丝阶段表达量最高.     

转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性

以表达水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）编码harpin广谱抗性激发子的hrf1基因的转基因系为材料,在温室和田间病圃鉴定它们对稻瘟病菌的抗性,分析转基因水稻抗稻瘟病的作用机制。研究结果显示,转hrf1基因水稻对稻瘟病菌ZC3、ZD1和ZG1小种表现高抗,对ZB13表现中抗,表明hrf1基因在水稻中表达可以产生非小种专化抗性。在稻瘟病圃中对水稻稻瘟病抗性鉴定结果显示,转hrf1基因水稻在T1、T3、T5和T7代对稻瘟病菌都表现很好的抗性,表明转hrf1基因水稻对稻瘟病菌的抗性能稳定遗传。 转hrf1基因抗病水稻中防卫反应基因OsPR1a、OsPR1b、PAL和Chia4a以及正向调控水杨酸介导信号传导的NPR1基因的表达显著增强。转基因抗病水稻中硅含量显著提高。Harpin编码基因在水稻中表达,可能通过激发水稻中防卫反应基因的表达,提高水稻中硅含量等,从而使水稻产生对稻瘟病菌的广谱抗性。     

转几丁质酶-葡聚糖酶基因水稻稻瘟病抗谱分析

用来源于云南各地属于24个稻瘟病菌（[i]Magnaporthe grisea[/i]）生理小种的33个菌株,对受体品种南29及其4个转几丁质酶 β-1,3-葡聚糖酶串联基因水稻T5代品系进行了温室接种鉴定。结果表明,不能侵染受体品种南29 的13个菌株也不能侵染转基因品系,可侵染受体品种南29 的20个菌株一般不能侵染转基因品系,转基因水稻对稻瘟病菌抗性范围较受体对照扩大,证明转几丁质酶 葡聚糖酶基因水稻对稻瘟病具有一定的广谱抗性;诱发条件下,转基因品系大田叶瘟病情指数为0～1级,穗瘟发病率为0.3%～10.23%,抗性较受体对照大幅度提高,表明这些品系在稻瘟病抗病育种中是有应用潜力的。     

水稻幼苗可溶性糖及可溶性蛋白含量与抗瘟性的关系

为了明确可溶性糖及蛋白含量与水稻抗瘟性的关系,本研究以抗病品种龙选9707(含Pi-b基因)、普粘7(含Pi-15(t)基因)和感病品种丽江新团黑谷(不含抗性基因)为材料,测定水稻幼苗叶片中可溶性糖含量及可溶性蛋白的含量变化。结果表明,水稻幼苗体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量在稻瘟病菌侵染初期与抗瘟性呈正相关,可溶性糖和可溶性蛋白含量高有利于水稻抗瘟性的表达,有利于水稻对稻瘟病抗性的提高。     

Osa-mi R439 Negatively Regulates Rice Immunity Against Magnaporthe oryzae

Osa-miR439 is a rice-specific microRNA family. Here we showed that Osa-miR439 acted as anegative regulator in rice immunity against blast fungus Magnaporthe oryzae. Osa-miR439 differentiallyresponded to M. oryzae between susceptible and resistant rice accessions. The accumulation ofOsa-miR439 was constitutively more in the susceptible accession than in the resistant one. Transgeniclines overexpressing Osa-miR439a (OX439a) showed higher susceptibility associating with lower inductionof defense-related genes and less hydrogen peroxide (H2O2) accumulation at the infection sites than thecontrol plants. In contrast, transgenic lines expressing a target mimic of Osa-miR439 (MIM439) displayedcompromised susceptibility associating with increased H2O2 accumulation. Furthermore, we found thatthe expression of three predicted target genes was decreased in OX439a but increased in MIM439 incomparison to control plants, and this expression was differential in susceptible and resistant accessionsupon M. oryzae infection, indicating that Osa-miR439a may regulate rice blast resistance via these genes.Our results unveiled the role of Osa-miR439a in rice blast resistance and provided the potentiality toimprove the blast resistance via miRNA.     

转录因子OPBP1和OsiWRKY基因的超表达提高水稻的耐盐及抗病能力

采用基因枪法将耐盐的OPBP1和抗病相关的OsiWRKY转录因子共转化入水稻材料秀水11,经PCR及分子杂交分析确认目的基因已整合到水稻基因组中并超量表达。抗病性测定表明,与未转基因水稻相比,转基因水稻植株表现出对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）的较好抗性。抗盐能力检测结果表明,在同等盐胁迫条件下转基因株系生长较快,叶绿素含量和生物学产量都显著高于未转基因对照。上述结果表明,OPBP1和OsiWRKY基因在水稻中增强表达可以提高水稻的耐盐及抗病能力。     

转抗菌肽B基因和bar基因籼稻植株的再生

 运用基因枪法将含有bar基因和cecropin B基因的质粒pCB1导入籼稻品种特青的幼胚细胞,筛选后得到3株转基因植株。PCR检测和Southern杂交结果表明,外源基因已整合到水稻基因组中。转化当代植株表现出对Basta很强的抗性,同时也增强了对水稻白叶枯病的抗性。     

Extracellular Antimicrobial Substances Produced by Bacillus subtilis JN005 and Its Control Efficacy on Rice Leaf Blast

【Objective】The purpose of this research is to assay stability, biological activity and efficacy of the extracellular antimicrobial substances produced by Bacillus subtilis JN005 against Magnaporthe oryzae. 【Method】The antimicrobial substances produced by B. subtilis JN005 was tested using different media. The activity of extracellular antimicrobial substances of JN005 strain against M. oryzae and its efficacy on rice leaf blast were measured by dural culture, optical microscope observation, indoor detached-leaf inoculation and live inoculation.【Result】B. subtilis JN005 secreted protease, cellulase, amylase and β-1,3-glucanase and its extracellular antimicrobial substances showed inhibition activity against M. oryzae. The extracellular antimicrobial substances were stable in a wide range of pH values from 2 to 12 and at temperatures from 0℃ to 100℃. The antifungal activity was retained after treatment with proteinase K. The extracellular antimicrobial substance kept its activity even it was irradiated for 12 h under ultraviolet light or exposed to 4℃ for 3 months. The extracellular antimicrobial substances caused distortion of hyphae of M. oryzae, and hindered the germination of conidia. Indoor detached leaves inoculation of Xiangwanxian 12 showed that disease incidence was 34.07% as rice leaves were treated with 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances, followed by inoculation with conidia suspension of M. oryzae (after 24 h). The control efficacy was close to that of 500 times-diluted 40% isoprothiolane EC. The disease incidence was 38.52% as rice leaves were inoculated with conidia suspension of M. oryzae and treated with 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances after 24 h, significantly different from 1500 times-diluted 75% tricyclazole WP and 500 times-diluted 40% isoprothiolane EC. The potted plant experiment showed that efficacy was 75.32% as rice was inoculated with conidia suspension of M. oryzae followed by spraying 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances before 24 h. The efficacy was 71.49% as rice was inoculated with conidia suspension of M. oryzae and followed by spraying of 100-fold dilution of the extracellular antimicrobial substances after 24 h.【Conclusion】The extracellular antimicrobial substances produced by JN005 strain directly inhibited mycelial growth and conidia germination of M. oryzae and it has good environmental stability. The extracellular antimicrobial substances have better preventative efficacy and therapeutic efficacy on rice blast and should be further investigated and developed as such.     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

 通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。     

CecropinB与Xa21基因共表达提高转基因水稻白叶枯病抗性

为了探明CecropinB与Xa21这两种不同抗病途径的基因单独或共表达后的田间抗白叶枯病表现,利用农杆菌转化技术,获得了这两个基因的单独和共表达后的植株。利用PCR等分子鉴定技术,证明这两个基因已经整合到水稻基因组中。抗病性检测结果表明,Xa21和CecropinB均能提高水稻对白叶枯病的抗性,且Xa21的抗病性较CecropinB明显。Xa21和CecropinB基因共表达后的植株的抗病性比单基因的更强,说明将不同抗性机制的基因共表达,可以在育种上利用以提高水稻的白叶枯病抗性。     

水稻抗病基因同源序列的克隆及测序分析

 根据已知的NBS LRR类及丝/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因结构中氨基酸的保守区域，设计了两组简并引物用于扩增广谱抗稻瘟病品种云系2号中的抗病基因同源序列。结果一共获得11类的NBS-LRR类抗病基因同源片段及16类的丝/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源片段。所有11类的抗病基因同源系列均含有NBS-LRR类抗病基因的保守序列，如P-loop、Kinase 2、Kinase 3a以及跨膜区域等。所有16类的蛋白激酶的序列均含有丝/苏氨酸蛋白激酶所共有的催化区Ⅵ（共有氨基酸序列：DLKPEN）、Ⅷ（共有氨基酸序列：GT/SXXYXAPE）以及蛋白激酶的其他催化区。两条NBS-LRR类的抗病基因同源片段YR1、YR12分别与抗病基因I2 C-2及Xa1氨基酸同源性很高(>50%)。7条丝/苏氨酸蛋白激酶类的抗病基因同源片段与已克隆的[WTBX][STBX]Xa21、Pto、Lr10[WTBZ][STBZ]等抗病基因的氨基酸序列超过60%的相同以及76%~78%的氨基酸类似。     

水稻抗白叶枯病基因Xa3/Xa26家族成员的表达模式分析

 水稻抗白叶枯病基因Xa3/Xa26是一个多基因家族的成员。为了检测该基因家族中是否可能存在其他抗病基因和这些成员可能发挥功能的部位,系统研究了Xa3/Xa26基因家族成员的表达模式。将籼稻品种明恢63、特青、93 11和粳稻品种日本晴中Xa3/Xa26基因家族的13个成员（MRKa、Xa3/Xa26、MRKc、TRKa、TRKb、TRKc、9RKa、9RKb、9RKe、NRKa2、NRKe、NRKf1和NRKf3）的启动子与编码绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因进行融合表达,通过农杆菌介导的遗传转化方法将不同启动子调控的报告基因分别导入水稻。通过检测GFP表达,分析这些家族成员的组织特异性表达模式,发现Xa3/Xa26基因家族成员的表达模式基本一致,主要集中在水稻各组织的维管束细胞及其周围细胞中。Xa3/Xa26基因家族的表达模式与抗维管束病原菌（如白叶枯病菌）基因的功能非常吻合。这种表达模式为寄主进化过程中,从该家族不断产生新的抗病基因提供了重要信息。