大豆在暗诱导条件下差异表达cDNA文库的构建及分析

大豆属于短日照植物,其生长发育对光周期反应非常敏感,这一特性严重阻碍大豆品种的适应性,是制约大豆单产提高的关键因素.本研究的目的是在细胞分子水平上从基因差异表达的角度研究短日照光周期诱导开花和衰老过程中基因转录物丰度的变化,从而探索大豆叶片感受日长变化诱导开花和衰老的复杂机制.利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)成功构建了短日照诱导的大豆光周期敏感品种‘东农L13‘叶片中差异表达的cDNA消减文库,从文库中一共筛选到738个克隆,通过反向Northern杂交,从中得到148个克隆并测序,它们代表76个不同基因的非重复序列ESTs.利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对,功能分析表明这些基因与植物的转录、信号转导和细胞凋亡的调控,解毒和防卫,大分子降解细胞壁修饰的合成代谢等多种植物的生理生化功能相关.本研究为揭示短日照诱导大豆开花和加速衰老的作用机理提供依据.     

Real-time PCR检测大豆CONSTANS基因在不同光照条件下的表达

采用实时荧光定量PCR方法检测了不同感光大豆品种的CO(CONSTANS) 基因在不同光照条件下的mRNA水平变化.结果表明:早熟品种东农49和晚熟品种东农42各自在短日照(8h/16h 光/暗)下会比长日照(16 h/8 h 光/暗)下表达有所增强,同时东农49中CO基因的表达要高于东农42,它们的表达峰值均出现在光暗交界处.东农42由长日照或短日照移入完全光或完全暗条件时,暗下CO基因的表达量剧增,并且大致维持之前长日照和短日照的表达规律.CO基因的表达有很强的昼夜节律性,暗下利于其表达,并且在不同感光品种中表达有所不同.     

大豆GmPic基因的分离及表达分析

对光敏感型大豆品种“中豆24”进行长日、短日和自然光3种光周期处理,采用cDNA-AFLP的方法筛选差异片段,并进一步通过RACE技术分离了该基因。该基因全长983 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码248个氨基酸,在遗传关系上与线粒体磷酸盐转运蛋白高度同源。通过半定量RT-PCR对该基因在不同光周期中的表达模式进行分析,结果表明,该基因在大豆生长发育的早期阶段表达,短日照抑制其表达,而长日照则增强其表达。因此,大豆线粒体磷酸盐转运蛋白基因可能是作为一种负调控因子参与大豆光周期反应。对大豆线粒体磷酸盐转运蛋白基因的研究能为进一步阐明大豆光周期反应分子机理打下基础。     

大豆GmGBP1基因启动子的光周期响应元件TCT-motif功能分析

GmGBP1基因的启动子的多态性位点SNP-796与生育期密切相关，SNP-796G为缩短大豆生育期的优异等位基因。本研究运用生物信息学手段分析发现，等位基因SNP-796 G→A变异会导致TCT-motif光效应元件的变异。将包括SNP-796位点的GmGBP1基因的启动子片段与Luciferase报告基因融合构建植物表达载体并转化烟草，结合烟草叶片中的农杆菌瞬时表达试验，分析了该启动子中TCT-motif顺式作用元件的功能。结果显示，TCT-motif受短日照条件诱导，引起Luciferase基因的表达显著上调。在短日照条件下，TCT-motif可能通过增加GmGBP1基因mRNA的表达量，从而缩短大豆品种的生育期。       

不同光周期处理对大豆开花结荚进程的影响

通过长日照（１６ｈ光／８ｈ暗）和短日照（９ｈ光／１５ｈ暗）相互转换处理，证明大豆品种“早１２”为相对短日植物，９个短日就可完成其成花的光周期诱导过程。大豆感受光周期效应的株龄在真叶期。短日诱导处理不仅促进花序产生的速度及数量，还有利于荚的发育；长日处理的结果恰相反。     

大豆GmIDD及其同源基因的生物信息学分析及功能预测

利用NCBI和Phytozome数据库进行GmIDD基因的同源基因检索,获取该基因在大豆不同染色体中5个拷贝的序列信息。通过对功能结构域的分析结果显示GmIDD基因5个拷贝均含有2个C2H2型(72~92 aa、114~142 aa)、2个C2HC型(149~169 aa、176~195 aa)锌指结构域。GmIDD基因cDNA序列全长为1 227 bp,编码408个氨基酸。系统进化树分析结果显示GmIDD基因5个拷贝中除了Glyma.14g10940和Glyma.17G228000外,其它IDD蛋白间进化距离较远,表明不同大豆IDD基因在功能上可能存在一定差异。长短日照处理下GmIDD表达量的分析结果显示GmIDD基因受短日照诱导表达,因此推测GmIDD可能参与大豆开花的调控过程。     

长日照对光周期敏感型大豆顶生花序发育的影响

顶生花序是识别大豆类型的重要组分,在本研究中,选用晚熟且对光周期敏感的大豆,研究长日照对此大豆顶生花序形成和发育的影响。出苗后,大豆幼苗经12h短日照,光周期13d,以便诱导顶生花序的开始。然后,把植株     

大豆SVP基因进化分析及调控开花功能研究

SVP(SHORT VEGETATIVE PHASE)基因是MADS-box家族一员，它通过介导不同开花途径调控下游基因表达，从而影响植物开花。本研究主要探究大豆SVP基因是否参与调控开花，为进一步深入解析大豆SVP基因的主要功能和调控机制提供依据。本研究利用同源比对与进化树分析鉴定出大豆SVP基因GmSVP01和GmSVP02,利用定量PCR检测GmSVP01和GmSVP02基因的表达模式以及不同生长发育时期的转录水平变化，通过拟南芥回补实验验证GmSVP01和GmSVP02基因调控开花的功能，并利用已发表的424份大豆自然群体材料的重测序数据对大豆SVP基因进行单倍型分析。结果表明：GmSVP01和GmSVP02两个基因主要在大豆营养生长阶段表达，且在顶芽和侧芽中的表达量较高，暗示其可能与组织分化及调控开花期的功能有关。长日照条件下的转基因拟南芥表型分析表明大豆SVP基因能够回补拟南芥svp突变体的早花表型，证明大豆GmSVP01和GmSVP02基因具有调控开花的功能，且与拟南芥SVP基因功能相似。单倍型分析表明GmSVP01和GmSVP02在大豆的进化过程中受到的选择程度不同。综...     

水稻OsENO2-2基因过表达对水稻抽穗期的影响

【目的】 OsENO2-2是OsENO2通过可变剪切产生的短转录本,其cDNA序列从粳稻中花11中分离获得。本研究的主要目的是初步分析OsENO2-2在水稻抽穗期调控中的作用。【方法】 构建了OsENO2-2的超量表达载体,获得转基因植株,通过对表型的观察和统计,分析目的基因在过量表达条件下的功能,并利用反向遗传学方法验证该基因的功能。【结果】 OsENO2-2过量表达导致水稻在长日照条件下的抽穗期推迟,而短日照条件下抽穗期无明显变化。通过qRT-PCR方法对水稻开花关键基因的检测发现,在长日照条件下,RFT1的表达量在超表达材料中显著下调,其他开花重要基因表达量在野生型和超表达材料中没有显著变化;而在短日照条件下,所有检测基因的表达量在野生型和超表达材料中均没有显著变化。【结论】 在长日照条件下,OsENO2-2主要通过调控RFT1基因的表达来调控水稻抽穗期。     

大豆光周期效应GmGBP1基因启动子多态性分析

GmGBP1 基因是植物开花途径中的重要基因，其启动子也受到短日照条件的强烈诱导。但是目前大豆 GmGBP1基因的启动子序列的多态性变异以及其与开花期的关系还不清楚。本试验对开花习性不同的36份大豆种质资源的GmGBP1基因的启动子序列进行了克隆测序，发掘了GmGBP1基因的启动子序列的自然等位变异，探讨了GmGBP1基因的启动子序列的自然变异与开花期的关系。研究结果表明，多态性位点SNP -796与开花期密切相关，其中SNP -796G为缩短大豆生育时期的优异等位变异。主要的3个单倍型与开花期也表现出极显著（P<0.01）的相关性，单倍型2和单倍型3为缩短大豆花期的优异单倍型。     

苎麻茎皮表达序列标签(ESTs)分析

以生长中期的苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud]茎皮为材料,构建库容量为2.2×105pfu/mL的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行测序和生物信息学初步分析,得到275条有效序列.通过与NCBI等数据库比对分析,获得已知功能基因或具推测功能基因的EST91条,已知EST37条,新的EST147条,具已知或推测功能的ESTs大致分为9类,其中与蛋白质合成有关的ESTs所占比例最大.cDNA文库的构建和ESTs分析为苎麻功能基因组学研究提供了一条方便快捷的途径.     

生长素相关基因在茶树腋芽冬季休眠不同生长阶段的表达分析

利用实时定量PCR技术研究了从本实验室构建的茶树休眠芽与萌动芽抑制消减杂交文库中分离出来的与生长素相关的基因片段在茶树腋芽冬季休眠不同阶段的表达模式。研究结果表明：（1）与生长素响应因子同源的6条EST片段中,有5条的表达量休眠期高于萌发期,另外1条则相反。（2）与生长素原初反应基因同源的3条EST片段的表达模式存在差异,其中与SAURs同源的EST在休眠阶段上调表达,休眠解除以后下调表达。而与GH3和Aux/IAAs同源的2条EST在萌发阶段有一个表达高峰,而在休眠期和萌发以后,表达量都下降。（3）与生长素结合类蛋白同源的茶树CsGLP1表达量在萌发期高于休眠期。（4）与生长素内向运输载体基因同源的EST片段在深休眠期的表达量最高。（5）2条受生长素调控的EST表现出不同的表达模式,生长素诱导表达的EST在休眠期的表达量高于萌发期及随后阶段,而另外1条受生长素抑制的EST片段在萌发期的表达远远高于休眠期。这些结果初步说明生长素促进茶树腋芽的冬季休眠。     

小麦SKC1 like基因的克隆及多样性研究

为了给小麦耐盐分子机制的研究提供参考,以水稻(Oryza sativa L.)耐盐相关数量性状基因SKC1(Shoot K+Content)的cDNA序列(GenBank登录号:DQ148410)为基础,通过搜索GenBank数据库找到2条与OsSKC1同源的普通小麦(Triticum aestivum L.)EST(GenBank登录号:DR734861,CK193616)。根据EST-DR734861设计引物筛选粗山羊草AL8/78(Aegilops squarrosa)BAC文库,通过BAC延伸测序克隆了粗山羊草AL8/78的SKC1-like基因(AeSKC1),进一步根据AeSKC1序列设计特异引物克隆了普通小麦SKC1-like基因(TaSKC1)。对人工合成双二倍体、地方品种和育成品种中TaSKC1的基因多样性分析表明,在驯化过程中TaSKC1瓶颈效应明显,属于驯化基因。     

油棕EST序列中SSR的分布特征分析

为充分利用现有公共数据库中的EST资源开发EST-SSR引物,本研究从GenBank数据库获取39 227条油棕EST,通过聚类拼接和处理,得到全长为7977.734 kb的无冗余序列15 716条。在这些序列中共检索出699个SSRs,检出率为4.45%,平均11.41 kb出现1个SSR,包括99种重复基元。其中,二核苷酸和三核苷酸重复是主要的类型,分别占总SSRs的38.48%和25.32%。在所有的核苷酸重复基序中,二核苷酸重复序列AG/CT所占比例最高,约占27.47%。Blastx分析发现44.95%的SSR-ESTs与非冗余蛋白质序列数据库(nr)中功能基因同源,功能已知的蛋白质中葡萄来源的SSR-ESTs所占比例最大,为4.42%。同时对54条SSR-ESTs通过GO体系进行功能分类,其中46条能找到同源物,其余8条无同源物,这些序列可划分为18个亚类,在所有功能亚类中,结合活性的功能项和SSR-ESTs数量最多,另外580条未被注释功能信息。本结果将为利用EST-SSR标记来研究油棕基因组学和开展分子育种工作提供参考依据。     

茶树ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶是植物乙烯合成过程中的关键酶之一,对乙烯的合成具有重要的调控作用。在茶树新梢cDNA文库测序所获得ESTs基础上,利用RT-PCR技术,克隆得到编码ACC氧化酶基因的全长序列,GenBank登录号为DQ904328。该基因长1232bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2kD,等电点5.41。多序列联配表明茶树ACC氧化酶具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树ACC氧化酶的亲缘关系最近。对经高、低温后的不同品种进行RT-PCR分析,结果发现ACC氧化酶基因的表达量与品种的抗逆性有一定的相关性。     

Heterosis Expression of Hybrid Rice in Natural-and Short-Day Length Conditions

Development of hybrid rice is an important strategy to increase yields of irrigated rice in China. Day length is a highly important environmental factor for hybrid rice adaptability,productivity and quality. Heterosis of hybrid rice has been utilized under natural-(long) day length conditions in the middle and lower reaches plain of Yangtze River Valley in China for a long time. However,whether the hybrid rice can show heterosis under short-day length conditions is unknown. In this study,we analyzed plant height,grain number per panicle,and other yield related traits of hybrid rice Liangyoupeijiu(LYP9) and its parents(Pei’ai 64 S and 93-11) under natural- and short-day length conditions and compared the respective heterosis. Results showed that earlier heading,reduced plant height,and reduced grain number per panicle were found in these three varieties under short-day length conditions relative to those under natural-day length conditions. In either natural- or short-day length conditions,heterosis of LYP9 was mainly displayed in grain number per panicle and plant height. This study may help in breeding and selecting suitable hybrid rice for different regions with natural- or short-day length.     

甘蔗EST-SSR标记的开发和多样性分析

运用生物信息学分析方法对甘蔗(Saccharum spp.)的282 809条表达序列标签(ESTs)进行分析,共获得Unigene 138 590条,发掘出分布于10 086条Unigene的10 505个微卫星(EST-SSR)位点,SSR发生频率为7.26%,平均9.22 kb出现1个SSR。在7个杂交甘蔗品种中,三核苷酸基元的SSR数量最多(74.95个/Mb),其次为二核苷酸基元的SSR(22.95个/Mb),二者占总数的90.27%。以CCG/CGG、AG/CT为重复基元的SSR是最常见的EST-SSR类型,富含G/C的EST-SSR占据极明显的优势。与拟南芥和水稻cDNA序列内SSR的比较表明,富含G/C的SSR可能是禾本科植物SSR的一个共同特点。研究发现,SSR在EST与基因组序列之间以及在不同甘蔗品种之间的分布存在差别,具有丰富的多样性。此外,从EST数据分析获得杂交甘蔗品种的16个保守基因,从中发掘了9个SSR位点。最后,利用Primer3和e-PCR软件设计了一批具有物种特异性和通用性的EST-SSR PCR引物,相关数据可以通过http://59.50.66.49/SSR/sugarcane/sugarcane.EST-SSR.tgz链接从因特网下载。该研究结果可为开展甘蔗遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子辅助育种提供参考。     

一个水稻类树稻突变体(leafy head 3)基因的精细定位

 从常规粳稻常优94后代中筛选到一份自然突变的抽穗期延迟的类树稻突变体lhd3（leafy head 3）。在短日照条件下,与野生型比较,lhd3突变体在生长后期,上部节间会继续长出叶片（一般为3片）和高位分蘖,类似于树的侧枝生长,抽穗期延迟,但基部分蘖数不受影响。经典遗传分析表明,lhd3与籼稻南京6号的F2群体中,正常植株与类树稻植株的分离比符合3∶1,说明此性状受单隐性基因控制。利用该群体进行图位克隆,将LHD3基因定位在水稻第1染色体短臂的两个新发展的STS标记wpla3和wpla25之间。再利用5个新发展的STS和CAPS标记,最终将该基因精细定位在WX6和CAPS1两个标记之间,物理距离约为60 kb。通过水稻基因组注释系统共预测到10个开放阅读框（ORF）。对该基因的进一步克隆将有助于阐明水稻生育期和叶原基发育调控机理。