高羊茅FeTOC1基因的克隆、差异表达及亚细胞定位分析

拟南芥TOC1基因是中央振荡器的重要组成部分,其编码的蛋白质TOC1通过光周期途径调控拟南芥对光照的响应.为了揭示高羊茅FeTOC1基因的生物学功能,本研究通过同源克隆获得该基因全长cDNA序列,对其在不同光照水平下的表达模式进行分析,并对其编码的蛋白质进行亚细胞定位.结果显示,高羊茅FeTOC1基因的全长cDNA序列...     

橡胶树hbYKt基因植物表达载体构建及亚细胞定位

SNAREs（soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白受体）参与囊泡运输,在植物中具有非常广泛和重要的生物学功能。我们从橡胶树胶乳消减cDNA文库中筛选获得橡胶树的SNARE基因,命名为hbYKt。为进一步研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达栽体pCAMBIAl304h-bYKt,通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞。荧光显微镜检测结果表明hbYKt定位在洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞的细胞质膜中。     

花生AhMKK4基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3'非编码区151 bp,5'非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。     

杆状病毒AcMNPV orf59基因的克隆表达、抗体制备及亚细胞定位

用PCR方法从苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）基因组中扩增到orf59基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建pET-Ac59质粒,再将该质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为30kDa的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞（Sf9）中orf59基因的表达,结果显示：在感染后的细胞中有两条分子量分别约为38kDa和25kDa蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现：在病毒感染的晚期,Ac59蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。这些研究为下一步深入进行Ac59功能的研究奠定了一定的基础。     

高羊茅春化基因FaVRN1亚细胞定位与差异表达分析

高羊茅在生长季出现生殖枝,抑制新枝形成,不利于草坪质量及其持久性生长。研究春化基因的分子特征,探索抑制生殖生长的分子育种新途径,对坪用型高羊茅品种改良具有重要意义。本研究在克隆高羊茅春化基因FaVRN1的基础上,构建高羊茅春化基因FaVRN1与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体p-FaVRN1-hGFP,利用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达,并运用实时荧光定量PCR分析春化基因FaVRN1在春化与非春化条件下的表达差异。研究结果表明,FaVRN1基因编码的蛋白产物位于细胞核,符合它作为转录因子特性;春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长逐渐增加。非春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长而降低。FaVRN1基因在春化条件下的表达水平远高于非春化条件,FaVRN1基因的表达受春化条件正调控。     

毛竹CesA基因鉴定及其表达调控研究

纤维素合成酶(CesA)是纤维素合成的关键酶。为探究毛竹(Phyllostachys edulis)中CesA基因的分子特征、表达模式及其调控关系,本研究采用生物信息学方法对毛竹CesA基因家族成员进行系统分析,基于毛竹RNA-Seq数据和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析CesA在毛竹组织中的表达模式,借助酵母单杂交技术验证转录因子MYB对CesA的调控作用。结果表明,在毛竹中共鉴定21个CesA(PeCesA1~PeCesA21),分别含有8~14个内含子;共线性分析发现19个PeCesAs存在片段复制,且Ka/Ks值均小于1.0。PeCesAs编码蛋白长度为904~1 093 aa,分子量在101.10~123.63 kDa之间,理论等电点为5.95~8.60;亚细胞定位预测所有PeCesAs都定位在质膜上;保守基序分析发现,PeCesAs共含有20个保守基序,均含有CesA家族的特征基序D、D、D和QxxRW。系统发育分析结果表明,毛竹等4个物种的CesA家族52个成员聚类成7个分支。RNA-Seq数据分析结果表明,PeCesAs(PeCesA1/5/10/11/17)在根以及不同高度笋的中部和基部的表达量存在明显差异,而且PeMYB35和PeMYB37均与PeCesA1/5/10/11/17存在较强的共表达关系。qRT-PCR结果进一步证实,随着毛竹笋高度的增加,PeMYB35与PeCesA1/5/10/11/17呈现相似的表达趋势。此外,PeCesA1/5/10/11/17的启动子序列中均包含MYB转录因子的结合位点GAMYB,酵母单杂结果证实PeMYB35能够与PeCesA1启动子中GAMYB元件相结合,可能会进一步调控基因的表达。该结果为研究毛竹中纤维素的生物合成机制提供了参考依据。     

陆地棉GhLipase基因的克隆、特征分析及定位

利用已构建陆地棉7235纤维cDNA文库测序, 结合5′RACE技术从陆地棉 (Gossypium hirsutum L) 7235纤维中获得了1个1 286 bp的cDNA。序列分析结果表明, 该cDNA 包含一个编码368个氨基酸的开放读码框, 5′非翻译区和一个带有Poly (A) 的3′非翻译区区域。与已报道的其它植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性, 命名为GhLipase,提交到GenBank, 登录号为EU273298。RT-PCR分析表明, GhLipase在棉花的胚珠及纤维细胞中优势表达。Southern blot分析结果表明, GhLipase在陆地棉基因组可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。     

牛支原体pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表达及亚细胞的定位

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病.丙酮酸脱氢酶复合体E1 (pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化.本研究参照GenBank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα (GenBank登录号:KU355295)及pdhβ基因(GernBank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR (Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ.表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E 1α亚基融合蛋白PDHA及PDHcE1β亚基蛋白PDHB.纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHcE1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究.结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白rPDHA及rPDHB的分子量分别约为40和37kD,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当.本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料.     

水稻中介体亚基的表达谱分析及亚细胞定位

中介体是一种大分子蛋白复合物,在真核生物的转录调控中发挥重要的作用。基因的时空表达控制着植物的生长和发育。虽然近年来拟南芥(Arabidopsis thaliana)中介体亚基的功能研究进展迅速,但对其基因的时空表达信息知之甚少。为研究水稻(Oryza sativa)中介体亚基基因的表达模式,以拟南芥中介体亚基基因为查询序列,在NCBI核酸数据库上进行搜索,共获得24个水稻中介体亚基基因,其中除了Med19存在两个拷贝以外,其余22个亚基基因均为单拷贝。利用水稻21个组织共59个样本的芯片数据,对23个中介体亚基基因的表达数据进行聚类,结果表明,OsMed12的表达组织特异性最强,其次为OsMed11,其他21个亚基基因表达无明显规律,较接近组成型表达。以GUS为报告基因的OsMed8启动子活性分析结果与其表达谱结果一致,可以看出在植株的分生组织、营养生长早期和生殖生长初期表达较强。亚细胞定位结果显示,OsMed6被定位在细胞核中;OsMed8定位在细胞核和细胞质膜中。本研究获得了水稻中介体基因的表达模式和蛋白亚细胞定位的重要的数据,对于进一步研究水稻中介体亚基的功能提供了很有价值的参考信息。     

两个水稻细卷叶等位突变体的基因定位

叶片形态是水稻重要的农艺性状之一。本研究分离了两个水稻突变体F2-102和S1-4,其表型为叶片宽度减小,叶片半卷及半矮化。遗传分析表明,这两个突变体均受单一核编码隐性基因控制,并利用Indel标记将其定位在第12号染色体长臂上。对定位区间内的编码类纤维素合成酶D4的基因OsCSLD4进行序列分析表明,突变体F2-102在第二个外显子缺失了8bp,而S1-4在第二个外显子发生单碱基替换,导致类纤维素合成酶D4功能缺失,引起细卷叶表型。     

结球甘蓝BoFBX117基因的克隆与表达分析

F-box基因在植物组织器官发育及非生物胁迫响应中起着重要的作用.为进一步探讨其作用机制,从结球甘蓝品种BoJF-16-1中利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到一个F-box基因BoFBX117,其cDNA全长为936 bp,编码311个氨基酸,蛋白分子量为30.14 kDa,等电点为9.71.该基因编码BoF...     

青花菜锌指蛋白基因BoCCCH1的克隆和表达分析

CCCH锌指蛋白广泛存在于真核生物中,在植物的生长、发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。为获知青花菜CCCH转录因子基因的序列特征和表达特性,从青花菜叶片中克隆到1个CCCH基因,命名为Bo CCCH1,同时,利用RT-PCR方法研究了其在不同器官及霜霉菌侵染叶片中的表达模式。序列分析结果表明,Bo CCCH1的基因组全长为1 568 bp,包含1个长度为599 bp的内含子,2个长度分别为627 bp、342 bp的外显子,编码322个氨基酸,蛋白质的分子量与等电点分别为35 296.42 Da和8.47;Bo CCCH1有2个锌指结构,类型均为C-X8-C-X5-C-X3-H。系统发育分析结果表明,Bo CCCH1与其它植物的21条同源序列在进化树上分为6组,来自十字花科的CCCH与Bo CCCH1处于同一分支。基因表达结果表明,Bo CCCH1在叶、花茎、嫩角果、花蕾和花中表达,其中花茎和嫩角果的表达量最高,但在根中未检测到表达;在霜霉菌侵染下,叶片Bo CCCH1的表达量升高,到24 h和36 h时达到最大,推测Bo CCCH1与霜霉病抗性相关。本研究为进一步探明Bo CCCH1在霜霉病抗性反应中的功能奠定了基础。     

平榛MAPKK基因克隆及在非生物胁迫下的表达分析

通过研究外界刺激信号对平榛中促分裂原活化蛋白酶途径的影响,探索该途径中MAPKK类基因对各种非生物胁迫的响应机制。根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR方法克隆到一个平榛MAPKK基因,全长1 065bp,推断其编码354个氨基酸,命名为Ch MAPKK2。序列分析表明,该基因含有MAPKK类型基因典型的磷酸一致化序列SLADIDS。构建的系统发育树结果表明,它与葡萄Vv MAPKK2以及苹果Md MAPKK的亲缘关系较近,相似性分别为81.69%和78.53%。采用qRTPCR,以ACTIN为内参对Ch MAPKK2基因在自然条件下花芽部位的表达模式进行分析,结果表明:在自然条件下从11月份到次年4月份Ch MAPKK2的表达量呈现先上升后下降的趋势;对平榛根蘖苗进行4℃、干旱及盐胁迫处理,发现Ch MAPKK2基因均受上述3种非生物胁迫的诱导而上调表达;Ch MAPKK2在不同器官中的表达具有组织表达特异性,雌花芽中表达量最高,其次是树皮,雄花序中表达量最低。上述研究结果表明Ch MAPKK2基因在平榛适应非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。     

黑田五寸胡萝卜中3个Orange基因的克隆与表达分析

在植物中Orange (Or) 蛋白对类胡萝卜素的生物合成和积累具有重要的作用。对胡萝卜全基因组分析后鉴定到3个Or基因,为分析3个Or基因与类胡萝卜素合成的相关性,以橙色胡萝卜品种黑田五寸为研究材料,克隆得到3个Or基因,并对其进行生物信息学分析及实时荧光定量(qRT-PCR)分析。序列分析表明,DcOr1、DcOr2和DcOr3的开放阅读框(ORF)全长分别为933、858 和939 bp,分别编码310、285和312个氨基酸;推测的氨基酸序列含有4个高度保守的富含半胱氨酸区域。DcOr1和DcOr3均由8个外显子和7个内含子组成,DcOr2由7个外显子和6个内含子组成。进化树分析显示,DcOr1与DcOr2进化关系最近,而DcOr3与三裂叶薯Or蛋白(XP_031112030.1)进化关系最近。qRT-PCR结果表明,3个DcOr基因在30、60、90和120 d的胡萝卜根中均有表达,其中DcOr2的相对表达量最低,DcOr3在各个阶段的相对表达量都为最高,在90 d时达到峰值,且相对表达量趋势与DcPSY1和DcPSY2最接近,推测DcOr3与胡萝卜类胡萝卜素合成最相关。本研究为探究胡萝卜生长发育过程中类胡萝卜素的生物合成机制提供了一定的理论依据。     

几种芸薹属作物APX家族基因的鉴定与序列分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物体叶绿体清除H₂O₂的关键酶。为了探究芸薹属作物中APX家族基因的序列特点和表达模式,本研究利用生物信息学方法,从大白菜、甘蓝和欧洲油菜中分别鉴定出10、9和22条APX家族基因,对这41个成员序列特点、染色体分布、CDS保守域、蛋白保守结构域、蛋白三级结构和系统进化关系等进行预测分析,并通过基因表达数据库分析这些基因在高温、干旱和生物胁迫等逆境条件下的表达模式。结果表明,APX在进化树上可分为8个亚族,分散在不同的染色体上;这些APX基因拥有相对稳定的CDS保守结构域、蛋白保守结构域和三级结构,都具有过氧化物酶功能域,在peroxidase功能域的后端均含有一个螺旋结构状的保守域Motif6。APX基因的Ka/Ks值均小于1,表明APX家族基因整体上正在经历纯化选择。大部分APX1和APX2基因在受到高温胁迫时表达上调,其中BrAPX2a在大白菜的胚和胚乳中强烈响应高温胁迫,但在大白菜其他部位表达微弱,存在一定的表达组织特异性。APX3、APX4等基因对干旱和高温胁迫响应不明显;甘蓝3个APX1基因在白粉虱...     

红掌AaMYB1基因的克隆、表达及异源转化研究

MYB类转录因子在植物观赏器官色彩形成中发挥关键作用。为了研究红掌中该类转录因子的种类、表达、作用机理等,本研究从红掌中获得了一个MYB转录因子的基因序列,通过反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、生物信息学软件分析、荧光定量PCR检测、构建超表达载体并异源转化烟草等手段,对该转录因子进行了初步研究。结果表明,该转录因子编码基因包含完整编码区,共计912 bp,编码303个氨基酸残基,序列组成与其他物种同源体具有高度相似性;荧光定量分析显示,Aa MYB1在红掌不同组织部位都有表达,但在苞片中表达量最高;获得了12株阳性转化株,形态观察发现转化株营养器官花色素累积程度随基因表达不同而异,但可使所有转化株花器官颜色显著加深。本研究结果为进一步探究MYB转录因子在红掌中调控花色素合成等信息提供了有益参考。     

毛竹PheDof2转录因子克隆及表达分析

Dof蛋白是单锌指结构蛋白家族之一,在植物生长发育和非生物胁迫中发挥重要作用.为了探索Dof转录因子在毛竹中的功能及表达特征,本研究以毛竹实生苗为材料,采取反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到PheDof2基因的cDNA序列,对其进行生物信息学初步分析,并检测其在毛竹不同高度笋、花发育,及不同胁迫处理下的表达情况....     

高粱SbJAZ1基因克隆与表达分析

JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L^-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功...