枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物功能分析

采用AKTA-epxlore层析系统,利用DEAE sepharose fast flow、Phenyl sepharose 6 F.F.和羟基磷石灰石柱层析后,分离纯化获得枯草芽孢杆菌Bs-916抗菌蛋白质Bacisubin.该蛋白质对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蓝黑斑病菌(A. Brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)和水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld)均有抑菌活性,尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力.枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难,致使菌丝顶端膨大,分支增加,胞壁加厚、断裂,从而抑制了病原菌的生长.研究发现抗菌蛋白具有凝集素活性和核糖核酸酶活性,无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性.     

枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质的性质

用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质,共获得8个蛋白质粗提物,其中硫酸铵饱和度为40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质具有较强的抑菌活性,研究结果表明:硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质浓度分别为17.261μg/m l和18.899μg/m l,上述两者对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性,对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性;当温度高于40℃时抑菌活性均降低,但在120℃时仍有部分抑菌活性;对pH值适应范围较宽,但在pH值为13.6时抑菌活性均丧失;经蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后,抑菌活性均下降。SDS-PAGE电泳结果表明枯草芽孢杆菌B-916能分泌多种蛋白质,其中硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质中相对分子质量为48 000的蛋白质可能为抗菌蛋白质。硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质经Sephadex G-100层析后检测到4个蛋白质吸收峰。     

枯草芽胞杆菌果糖基转移酶基因的克隆及其序列分析

利用自行设计的引物,在枯草芽孢杆菌基因组内获得果糖基转移酶基因,基因和相应蛋白序列分析发现.该基因共1 422个碱基,编码473个氨基酸,与GenBank注册的sacB基因序列有89%的相似性;全长序列有152突变碱基,共造成18个氨基酸的错义突变,但没引起酶保守活性位点的关键氨基酸突变.这结果为后期表达特异连接α1→2糖苷键的果糖基转移酶或者该基因的定点突变打下基础.     

枯草芽孢杆菌Bs-0728菌株发酵条件的优化

枯草芽孢杆菌Bs-0728是对苹果再植病害具有良好防治效果的菌株｡为了提高Bs-0728发酵液的活菌数量和抑菌效果,本研究通过单因素试验筛选及正交试验,对该菌株进行了液体发酵培养及配方优化｡试验中以茄腐镰刀菌FsP4菌株作为指示菌,以抑菌带宽度和OD 值作为评价指标,经测试得到最佳培养配方为:玉米粉 2%,酵母粉2%,磷酸二氢钠0.1%+磷酸氢二钠0.1%;最适发酵条件为:初始接种量1mL,装液量30mL/300 mL,初始pH 值7.5,发酵温度32℃,160r/min振荡培养12h｡优化后Bs-0728对病原菌的抑菌带宽增加到1.04cm,比初始培养条件下提高了85.7%,OD 值达到0.839,比初始培养条件提高了107.7%｡     

枯草芽孢杆菌Bs-916草酸脱羧酶基因Bacisubin的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析

为明确枯草芽孢杆菌生防菌株Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin的编码基因,并初步解析Bacisubin的抑菌机理,根据该蛋白质的部分序列设计简并引物,获得了编码基因的部分序列,参考基因组数据库克隆了Bacisubin基因全序列。将Bacisubin基因克隆至PET28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达获得His标签融合蛋白质,并利用次甲基蓝-重铬酸钾法初步检测了该融合蛋白质的酶催化活性。克隆获得Bacisubin基因开放阅读框序列共1 161 bp,G+C含量为51.3%,可编码386个氨基酸,编码蛋白质与Bs-168菌株的草酸脱羧酶Yvrk蛋白质的氨基酸相似度为87%,与其他多种细菌和真菌的草酸脱羧酶的N端和C端Cupin活性中心区域和Mn2+结合区域高度保守。预测Bacisubin分子量为43 600,等电点为5.18,是较稳定的可溶性草酸脱羧酶,其催化最适pH为6.0左右,最适温度为30℃左右。说明枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin为草酸脱羧酶,抑菌作用可能与其降解草酸的能力有关。     

拮抗枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其发酵优化

为了根治植物病害,提高农业生产率,培养出对植物病原菌具有抵抗作用的防治细菌,从植物根部的土壤中分离出一株对多种病原真菌具有生长抑制作用的枯草芽孢杆菌,在一段时间之后对病原菌菌丝进行细致观察,此菌对层出镰刀菌,串珠镰刀菌,腐皮镰刀菌,尖孢镰刀菌等均具有抑制其活性的作用。经过对16SrRNA序列分析及该菌形态生理特征等各方面的分析,结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),经过前一过程的提取分析后,继而对其发酵培养基进行了进一步的优化。     

枯草芽胞杆菌B44菌株培养与发酵的优化条件研究

采用单因素试验和正交试验设计法L16(44)对拮抗细菌——枯草芽孢杆菌B44的液体发酵培养基和发酵条件进行优化试验,确定了在最优培养基Wakimotos’下,温度为30℃,pH值为7,装液量为90mL,培养24h的条件下其粗提液对小麦全蚀病菌和苹果腐烂病菌的抑制效果最好,抑菌率分别达到70.250 0%和60.510 0%。     

全基因组预测枯草芽孢杆菌BEST195的分泌蛋白

枯草芽孢杆菌BEST195作为纳豆菌的一种,是纳豆生产的重要菌株之一。利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等预测程序对该菌中4456条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小、信号肽切割位点等性质进行分析。结果表明：枯草芽孢杆菌含有分泌蛋白102个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A X A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了枯草芽孢杆菌BEST195分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守型特点。     

全基因组预测枯草芽孢杆菌XF-1的分泌蛋白

枯草芽孢杆菌XF-1对诸多植物病原菌具有抑制作用,是农业生产上重要的生防菌之一。利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等预测程序对枯草芽孢杆菌中3 853条蛋白质序列进行分泌蛋白的预测研究,并对所获得的分泌蛋白开展氨基酸分布、信号肽长度、切割位点等性质进行分析。结果表明,该菌含有分泌蛋白为104个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了枯草芽孢杆菌分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守型特点。     

枯草芽胞杆菌SYL-6脂肽类抗生素发酵条件优化研究

以枯草芽孢杆菌SYL-6为出发菌株,研究了发酵过程中不同培养条件对该菌株产生脂肽类抗生素的影响。结果表明:最有利于脂肽类抗生素产生的发酵条件是发酵时间72h、发酵培养温度31℃、初始pH值7.0、摇瓶装液量120mL/250mL时。     

芽孢杆菌蛋白酶基因的比较基因组学分析

【目的】研究芽孢杆菌产蛋白酶能力与携带的蛋白酶基因的关系,探寻影响芽孢杆菌产蛋白酶能力的重要基因。【方法】通过 筛选培养基筛选能够产生蛋白酶的菌株,采用福林酚法 检测菌株产生的蛋白酶的活性,对 15 株芽孢杆菌分离株进行全基因组测序,获得菌株染色体上携带的蛋白酶基因情况并将其分类;采用实时荧光定量 PCR 方法检测蛋白酶基因 mRNA 的转录水平;通过比较基因组学和细菌全基因组关联分析（BGWAS）,探讨影响细菌产蛋白酶能力高低的原因。【结果】根据菌株染色体上携带的蛋白酶基因情况,可分为 7 种基因型（G1~G7）。比较基因组学和 BGWAS 分析发现,细菌染色体上携带的蛋白酶基因种类的多寡与其产蛋白酶能力的高低有直接关系,且缺少 aprX 和 aprE 基因菌株的产蛋白酶能力明显下降。进一步研究基因 mRNA 水平发现,芽孢杆菌产蛋白酶能力的差异与 aprX 的表达水平有关。【结论】 菌株染色体上携带的蛋白酶基因情况与菌株产蛋白酶能力之间存在关联。aprX 是影响芽孢杆菌属细菌产胞外蛋白酶能力的重要基因。     

功能基因组学研究的有力工具 --比较基因组学

比较基因组学在后基因组时代是一门重要的工具学科。通过不同物种间的基因组序列比较,可以发现生物体中蕴涵的大量生物学信息,其在功能基因组学的研究中将发挥重要作用。文章对比较基因组学的基本理论、应用策略、主要分析步骤及有关分析工具进行了概述。     

Molecular mapping of YrTZ2, a stripe rust resistance gene in wild emmer accession TZ-2 and its comparative analyses with Aegilops tauschii

Wheat stripe rust, caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst), is a devastating disease that can cause severe yield losses. Identification and utilization of stripe rust resistance genes are essential for effective breeding against the disease. Wild emmer accession TZ-2, originally collected from Mount Hermon, Israel, confers near-immunity resistance against several prevailing Pst races in China. A set of 200 F_6:7 recombinant inbred lines (RILs) derived from a cross between susceptible durum wheat cultivar Langdon and TZ-2 was used for stripe rust evaluation. Genetic analysis indicated that the stripe rust resistance of TZ-2 to Pst race CYR34 was controlled by a single dominant gene, temporarily designated YrTZ2. Through bulked segregant analysis (BSA) with SSR markers, YrTZ2 was located on chromosome arm 1BS flanked by Xwmc230 and Xgwm413 with genetic distance of 0.8 cM (distal) and 0.3 cM (proximal), respectively. By applying wheat 90K iSelect SNP genotyping assay, 11 polymorphic loci (consisting of 250 SNP markers) closely linked to YrTZ2 were identified. YrTZ2 was further delimited into a 0.8-cM genetic interval between SNP marker IWB19368 and SSR marker Xgwm413, and co-segregated with SNP marker IWB28744 (co-segregated with 28 SNP). Comparative genomics analyses revealed high level of collinearity between the YrTZ2 genomic region and the orthologous region of Aegilops tauschii 1DS. The genomic region between loci IWB19368 and IWB31649 harboring YrTZ2 is orthologous to a 24.5-Mb genomic region between AT1D0112 and AT1D0150, spanning 15 contigs on chromosome 1DS. The genetic and comparative maps of YrTZ2 provide a framework for map-based cloning and marker-assisted selection of YrTZ2.     

昆虫病原真菌基因组学及多组学研究进展

昆虫病原真菌是重要的生物防治资源,利用昆虫病原真菌防治农业害虫具有不易产生抗性、易造成昆虫病害流行、生态安全环保等优势,推广应用昆虫病原真菌控制害虫是今后生态农业的发展趋势.现代测序技术的飞速发展促进了真菌基因组学的研究,在全基因组测序、系统发育基因组学、比较基因组学以及多组学(转录组学、蛋白组学、代谢组学)联合分析等...     

萝卜抽薹开花相关基因的研究进展

通过构建萝卜抽薹开花相关基因的cDNA文库,获取大量的EST序列,并与十字花科模式植物拟南芥、白菜等进行比较基因组学研究,研究结果显示:萝卜与拟南芥、白菜等植物基因组具有很高的同源性,控制抽薹开花的相关基因在不同物种中具有保守性。拟南芥抽薹研究表明,抽薹开花过程受多基因控制,具有多种调控途径。抽薹开花是一个复杂的过程,其中FLC、FT、LFY等基因处于关键位置。目前这些关键基因在萝卜EST序列中已经发现了同源片段,并进行了一些基因克隆,结合萝卜基因组测序的完成,未来萝卜抽薹研究将进入基因功能验证和全基因组调控模式研究之中。     

严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒基因组比较分析与进化研究

“严重急性呼吸道综合征”(SARS)由于危害严重,引起人们的高度重视,在各国科研人员努力下,目前已完成了十几个毒株的分离与全基因组测序工作。本研究对世界各地分离的SARS毒株的基因组全序列进行比较,发现不同毒株的同源性在99．8％以上,SARS病毒的遗传稳定性较高;将SARS病毒与其它冠状病毒基因组以及编码蛋白质序列进行比较分析,证实SARS病毒是一种新的冠状病毒,可能进化起源较早,并发现SARS病毒和牛冠状病毒同源程度最高。SARS病毒orflab、orfla、S、M、N编码区氨基酸序列和牛冠状病毒同源程度最高,鼠肝炎病毒次之。     

植物病原细菌Pseudomonas syringae pv .tomato DC3000 致病基因 比较基因组及原核表达分析

番茄细菌性叶斑病是由Pseudomonas syringae pv .tomato 引起的一种世界范围内广泛发生的植物细菌 性病害, 其模式菌株DC3000 已完成全基因组测序。试验通过比较基因组学方法将该模式菌株基因组中的致病 基因与其他已完成全基因组测序的植物病原细菌的基因组序列进行比对, 得到3 个DC3000 菌株特有的致病基 因PSPTO_4707 、PSPTO_4708、PSPTO_4711 , 并对PSPTO_4711 基因进行原核表达和蛋白活力检测, 发现其 表达的活性蛋白对拟南芥具有很强的毒性。     

小麦抗叶锈病基因LrAlt的比较基因组学分析

斯卑尔脱小麦材料Altgold含有小麦抗叶锈病基因LrAlt。该基因被定位于小麦2A染色体短臂末端。本研究基于小麦与短柄草和水稻基因组良好的共线性关系,对小麦抗叶锈病基因LrAlt进行比较基因组学分析,发现该基因所在基因组区域对应于短柄草第5染色体和水稻第4染色体的直系同源基因组区域,据此开发出与LrAlt连锁的EST-STS标记BE498683、BE471132.1、BG605273和CD454629,并构建了LrAlt的遗传连锁图谱,这4个EST-STS标记与Xbarc212共分离,位于LrAlt近着丝粒侧,距离LrAlt 1.9cM。同时,通过筛选Graingenes 2.0公布的位于LrAlt附近的SSR标记,发现Xbarc124、Xgwm614与LrAlt紧密连锁,均与Xbarc212共分离。本研究通过比较基因组学的策略和筛选Graingenes 2.0公布的SSR标记,共得到与LrAlt紧密连锁的9个新的分子标记,为构建LrAlt的高密度精细遗传连锁图谱、分子标记辅助选择和基因聚合奠定了基础。     

黄瓜苗期主要根部病害生防菌筛选及应用研究

为减轻和控制黄瓜苗期根部病害的发生,以黄瓜苗期立枯病、猝倒病和枯萎病为防治对象,进行生防细菌的筛选及应用研究。结果表明:枯草芽孢杆菌KC1、KC6和KC20对黄瓜苗期根部3种病原菌具有较好的拮抗作用;将3种生防菌制成混合的粉剂,保存13个月后有效含量低保持在较高水平;生防菌剂使用剂量在10g·m-2对黄瓜苗期根部病害防治效果最佳达到64.12%。