微小隐孢子虫LCCL结构域基因的克隆及原核表达

为探讨微小隐孢子虫的入侵机制,克隆、表达了微小隐孢子虫LCCL结构域基因。从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中,采用PCR随机扩增LCCL结构域基因。与Pmd-18-T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析。用基因重组技术将LCCL结构域基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建LCCL结构域基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-LCCL。重组质粒经酶切、测序鉴定后转入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。最终得到了在大肠埃希菌中高效表达的重组蛋白,分子质量大小约为37ku,并且具有反应原性,为进一步研究微小隐孢子虫的入侵机制奠定了基础。     

大肠埃希菌O157∶H7 eae A基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。     

大肠埃希菌O157:H7 eaeA基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物，应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌0157：H7021210的染色体DNA中扩增出既8A基因的完整阅读框，得到了一条大小约为2800bp的基因片段。T—A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋），经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定，证实成功构建原核重组表达质粒pET—eaeA。大肠埃希菌O157：H7eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建，为下一步进行诱导表达、活性鉴定及既8A基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

犬β-防御素cBD103的原核表达和纯化

将犬β-防御素103(canineβ-defensin 103,cBD103)基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-cBD103,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,并用肠激酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果表明,质粒pET-cBD103经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,大肠埃希菌中成功表达出目的蛋白,蛋白大小约为24ku,以可溶性表达为主。经过纯化和酶切,得到大小8ku的cBD103,与预期大小一致。该研究在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,为下一步大规模制备cBD103奠定了基础。     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv9O基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经S...     

长白猪λ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-λ基因的质粒载体为模板，用原核表达引物扩增了长白猪IFN-λ，基因，将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRI和XhoI位点，构建了长白猪IFN-λ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-λ。经酶切、PCR鉴定，表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-λ，基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）细胞，阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明，成功构建了表达重组猪IFN-λ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明，目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。     

羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达

根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32.再将P32基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析.结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58 ku左右,与预期大小相符.