解淀粉芽孢杆菌NS2降解玉米赤霉烯酮的研究

为了丰富玉米赤霉烯酮(ZEN)解毒菌种库,通过采集湖南省邵阳市等7个省市粮食样品,筛选获得1株能够高效降解ZEN的解淀粉芽孢杆菌NS2。采用高效液相色谱法检测降解前后ZEN的含量发现,液态发酵72 h,该菌对5 mg·L^-1 ZEN标准品的降解率高达96.0%,固态发酵72 h,菌株对玉米粉中2.5 mg·L^-1 ZEN标准品的降解率高达88.2%。采用高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用技术检测该菌处理后的ZEN降解产物,未检测出具有毒性作用的α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)等ZEN的类似物。此外,抗菌活性试验与木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶活性试验显示降解菌NS2还能通过产生具有抗菌作用的次生代谢产物,抑制病原微生物大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长。上述结果表明,解淀粉芽孢杆菌NS2可以高效降解ZEN,具有潜在应用前景,为ZEN解毒产品的开发与应用奠定了材料基础。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达

玉米赤霉烯酮(ZEN)是具有雌激素作用的次生代谢产物,可以被来源于Gliocladium roseum的内酯水解酶降解为无毒物质。为了实现玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达,获得不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,本研究采用一步克隆及重叠延伸PCR的方法构建了单启动子和包含Hpa Ⅱ和P43双启动子的表达质粒,将质粒转化到枯草芽孢杆菌中,获得重组菌株168/pMA5-zlhy-6和168/pMA5-P43-zlhy。然后构建了重组整合载体amy-p43-zlhy,将zlhy-6基因整合到枯草芽孢杆菌168的基因组中。通过Cre/lox系统敲除抗生素抗性基因,获得整合了P43-zlhy表达盒的食品级重组枯草芽孢杆菌BZ-zlhy。将构建的3个重组菌株在37℃、pH值7.5条件下培养36 h,结果显示,双启动子表达载体重组菌株的最高酶活性为2.2 U·mL^-1,是单启动子菌株的1.2倍。双启动子重组菌株表达的降解酶对ZEN(4 μg·mL ^-1,30 min)的降解率为65.1%。重组菌株枯草芽孢杆菌BZ-zlhy表达水平最低(0.4 U·mL^-1)。本研究实现了玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中表达,同时构建了不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产奠定了基础,也为解决粮食储藏和饲料生产中的ZEN污染提供了思路。     

一株高效降解玉米赤霉烯酮的耐酸耐高温枯草芽孢杆菌的研究

为寻求更高效、实用的生物脱毒制剂,提高其应用范围,通过采集酸性、高温的温泉环境样品,筛选获得1株高效降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的细菌菌株Y-33,并对该菌株生长和降解特性进行分析。结果表明,菌株Y-33在50℃、pH值5.0条件下孵育36 h,菌液对2 μg·mL^-1 ZEN的降解率高达93.79%,对20 μg·mL^-1 ZEN的降解率也达82.40%。从形态、生理生化特性及16S rDNA序列对菌株Y-33进行分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株发酵上清液在28℃条件下对ZEN降解率为62.02%。金属离子Mn²⁺能明显增强菌株Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率达81.17%,而Zn²⁺严重抑制了Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率仅为5.42%。本研究结果为ZEN解毒菌剂的开发与应用奠定了理论基础。     

拉曼光谱法检测玉米中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮

为提高激光拉曼光谱技术对不同霉变程度玉米中的黄曲霉毒素B₁(AFB₁)和玉米赤霉烯酮(ZEN)检测的准确率,本试验以6个不同霉变等级的玉米样品为研究对象进行拉曼光谱检测。首先采用迭代多项式拟合基线校正方法对原始拉曼光谱进行基线校正,去除荧光背景;然后采用多元散射校正(MSC)、标准正态变量变换(SNV)和高斯-洛伦兹混合函数峰位拟合(Gauss-Lor)3种方法对光谱进行预处理,并对预处理结果进行对比,确定GaussLor方法更为合适;运用竞争性自适应重加权算法(CARS)对AFB₁和ZEN分别选取了22和36个特征波长;最后运用BP神经网络(BPNN)和偏最小二乘(PLS)、支持向量机(SVM)分别在特征波长和全波长下对2种毒素含量进行预测。结果表明,基于所筛选出的特征波长光谱信息所建立的BPNN模型预测效果最佳,其对AFB₁和ZEN含量预测值的相关系数(R²)和均方根误差(RMSE)分别为0.986 9、0.098 7和0.967 3、0.092 2。本研究结果为激光拉曼光谱技术快速检测玉米中真菌毒素提供了一定的借鉴,并为其他谷物中真菌毒素的拉曼检测提供了参考。     

利用实时荧光定量PCR筛选新蚜虫疠霉内参基因

内参基因的准确选择是利用实时荧光定量PCR进行准确分析基因相对表达量的前提。虫霉目真菌新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)是重要蚜科专化性病原真菌,经常引发多种作物上蚜虫种群的流行病。本研究通过实时荧光定量PCR分析了新蚜虫疠霉ARSEF 5403中3个传统管家基因18Sr RNA(18S)、28Sr RNA(28S)和延伸因子1α相似蛋白(elongation factor-1 alpha-like protein,EF1)m RNA表达差异情况,并利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件综合分析了其在4个生长阶段(分生孢子、萌发管时期、短菌丝和长菌丝)和3种营养条件(GLEN培养基、OS-SDB培养基和Grace培养基)下表达的稳定性。结果表明,基于公共数据库序列设计的候选内参基因的引物具有良好的扩增效率和特异性。经ge Norm软件分析,新蚜虫疠霉在不同生长阶段和不同营养条件下3个候选内参基因的平均表达稳定性(M值)分别为:18S(0.457)28S(0.534)EF1(0.749)和18S(0.389)28S(0.557)EF1(0.607)。利用Norm Finder软件分析,新蚜虫疠霉不同生长阶段和不同营养条件下3个候选内参基因的平均M值分别为:18S(0.084)28S(0.264)EF1(0.509)和18S(0.118)28S(0.355)EF1(0.403)。而Best Keeper软件分析得到的稳定性等级有所差异,在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因28S表达最稳定,18S次之,EF1最不稳定。综合分析3款软件对荧光定量PCR结果的稳定性等级的平均值,得出在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因18S表达最为稳定。筛选出的18S可作为分析新蚜虫疠霉基因表达差异的一个较为可靠的内参基因,同时为后续研究新蚜虫疠霉的生长、毒力相关基因的表达分析研究提供技术支持。     

谷物中链格孢毒素的研究进展

链格孢毒素是由链格孢霉产生的广泛污染谷物和饲料的真菌毒素,其中最主要的几种链格孢毒素有交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)、交链孢烯(ALT)、交链孢菌酮酸(Te A)和交链孢毒素(ATX),本文系统的总结了谷物中链格孢霉毒素的污染来源、毒性作用机制、检测方法和降解研究进展,旨在为谷物中链格孢毒素的消解提供技术基础,从而减少谷物的污染损失,保障粮食质量安全。     

致病疫霉坏死基因PcF/SCR.1的克隆及功能分析

PcF(Phytophthora cactorum-fragaria)蛋白是一类只存在于疫霉属(Phytophthora)中的重要致病因子。致病疫霉(Phytophthora infestans)基因组学研究预测出了20个PcF/SCR(small cysteine-rich)-like基因,但其对寄主植物的致坏死功能尚未被证实。本研究选取其中编码蛋白被预测具有4个二硫键的基因PcF/SCR.1(GenBank:XM_002902885),对其进行基因克隆和致坏死功能分析。利用RT-PCR获得336 nt的全长cDNA,将其连入表达载体pBI121后,转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,注射接种本生烟(Nicotiana benthamiana),观察叶片症状。在注射接种后5 d时叶片开始出现黄化,7 d时叶片出现严重皱缩和坏死症状,初步表明该基因具有致坏死功能。序列比对分析表明,PcF/SCR.1基因编码的蛋白具有与PcF蛋白相类似的3个二硫键(C89和C99,C68和C100,C73和C104)和1个仅存在于PcF/SCR.1的潜在二硫键(C88和C110),推测其在维持蛋白结构功能方面发挥重要作用。为深入了解PcF/SCR.1基因的致坏死功能,利用试剂盒定点突变该基因编码蛋白的第99、100、104和110位上的半胱氨酸,构建缺失二硫键突变体的重组质粒,并在本生烟中进行瞬时表达。仅突变110位半胱氨酸,或者同时突变99位和110位两个位点的半胱氨酸时,PcF/SCR.1基因的致坏死功能并没有受到影响;当半胱氨酸的突变个数增加到3个(C99/100/110A)或者4个(C99/100/104/110A)时,接种烟草叶片没有出现坏死症状,表明二硫键在该基因的致坏死功能中具有重要作用。为进一步了解PcF/SCR.1基因在致病疫霉侵染马铃薯(Solanum tuberosum)过程中的表达模式,利用荧光定量RT-PCR分析其在不同侵染时期表达量的变化,结果显示,该基因在整个侵染过程中均有不同程度的上调,而且在接种48 h时表达量达到最高值,说明该基因可作为毒素因子在病菌侵染马铃薯叶片的整个过程中都起作用,而且主要作用可能是在侵染后期(48 h)通过分泌大量的毒素蛋白来破坏寄主的防御系统进而促进自身的定殖。对PcF/SCR.1基因致坏死功能的研究,有助于深入了解该基因在致病过程中的作用及机制,为PcF/SCR-like家族其他基因的功能研究提供参考。     

60Co-γ辐照模式下玉米中赤霉烯酮和品质的变化及对绵羊定时人工授精的影响

为研究经赤霉烯酮(ZEN)自然污染与⁶⁰Co-γ辐照处理后的玉米对绵羊定时人工授精中澳洲白种公羊、湖羊母羊的生殖性能的影响,本试验选取含ZEN玉米样本,分别用0、3、5、8、10 kGy剂量的⁶⁰Co-γ辐照,并测定辐照后玉米主要营养成分变化。然后分别将未污染玉米(Ⅰ对照组)、经10 kGy ⁶⁰Co-γ辐照的污染玉米(试验Ⅱ组)、污染玉米(试验Ⅲ组)饲喂定时人工授精的绵羊,检测澳洲白种公羊的精液质量,测定湖羊母羊的繁殖性能指标。结果表明,未经⁶⁰Co-γ辐照的玉米含ZEN 2 153 μg·kg^-1,在10 kGy ⁶⁰Co-γ辐照剂量下,玉米中ZEN降解率为83.7%;当⁶⁰Co-γ辐照剂量低于10 kGy时,玉米淀粉表面结构无变化,主要营养成分无显著变化。试验Ⅱ组澳洲白种公羊的采精量、精子活力、精子密度与试验Ⅲ组相比显著升高(P<0.05),与Ⅰ对照组相比无显著差异(P>0.05);试验Ⅲ组澳洲白种公羊第30天精子畸形率与试验Ⅱ组、Ⅰ对照组相比均显著升高(P<0.05),显微镜下观察可见双尾精子、双头精子、无尾精子等现象,其中双尾精子头部、尾部不完整;试验Ⅱ组湖羊母羊同期发情率、受胎率、产羔率和羔羊始重等指标与试验Ⅲ组相比显著升高(P<0.05),与Ⅰ对照组无显著差异(P>0.05)。综上,使用经10 kGy ⁶⁰Co-γ辐照后ZEN含量低于2 153 μg·kg^-1的玉米饲喂繁育绵羊,对绵羊定时人工授精无不利影响。本研究结果为⁶⁰Co-γ辐照模式下玉米中赤霉烯酮和品质的变化对绵羊定时人工授精的影响研究提供了理论依据。     

广西南宁地区腐霉的研究

分别于广西壮族自治区南宁地区 1 1个县 (乡 )采集土壤腐霉 (Pythium )标样 1 0 6个 ,研究分离纯化出 1 72个腐霉菌株 ,其中有 2个新种 ,为镰雄腐霉Pythiumfalciformesp .nov .和南宁腐霉P nanningensesp .nov .;6个广西新记录种 ,为刺器腐霉P acanthophoronSideris、昆明腐霉P kunmingenseYu、畸雌腐霉P irregulareBuisman、奇雄腐霉P middletoniiSparrow、缓生腐霉P tardicrescensVanterpool和终极腐霉P ultimumTrow。优势种为瓜果腐霉P aphanidermatum (Edson)Fitzpatrick和刺腐霉P spinosumSawada。     

玉米赤霉烯酮的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光技术建立高灵敏的玉米赤霉烯酮（ZEN）间接竞争免疫分析法（ZEN-TRFIA）。以玉米赤霉烯酮人工抗原（ZEN-BSA）包被96孔板为固相抗原，与ZEN标准或样品中的ZEN共同竞争有限的抗ZEN的单抗；用稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪。该方法的灵敏度为0.01 μg/L（10ppt），测量范围为0.01-20 μg/L，批内和批间变异分别为7.2%和14.6%，平均回收率为94.4%，与玉米赤霉醇（ZER）的交叉反应率为15.16%。7条不同时间进行的ZEN-TRFIA的效应点值ED20、ED50、ED80分别为0.156±0.035 μg/L、0.634±0.091 μg/L和2.595±0.274 μg/L。试剂盒4℃保质期超过6个月。研究表明，ZEN-TRFIA是目前报导的ZEN检测中较灵敏的方法，该分析方法稳定性好，货架期符合要求，可测范围宽，具有很好的应用前景。     

Chemical moieties and interactions involved in the binding of zearalenone to the surface of Lactobacillus rhamnosus strains GG

Viable, heat-and acid-killed Lactobacillus rhamnosus strain GG (LGG) has shown high binding properties with zearalenone (ZEN). To identify the type of chemical moieties and interactions involved in binding with the ZEN, LGG was subjected to different chemical and enzymatical treatments, prior to the binding experiments. Pretreating the viable, heat- and acid-killed bacteria with m-periodate significantly decreased ZEN binding, suggesting that ZEN binds predominantly to carbohydrate components. Pretreatment with Pronase E had no effect on the ability of viable cells to bind ZEN, however, a reduction in the binding of ZEN by heat- and acid-killed cells, suggesting that the new binding sites exposed by heat or acid are proteins in nature. Pretreatment with urea also decreased binding, suggesting that hydrophobic interactions play a role in ZEN binding. The binding of ZEN in concentrations ranging from 0.79 to 62.82 microM and its subsequent dissociation by repetitive aqueous washes was also studied. The binding sites of the bacteria were not saturated by the maximum ZEN concentration studied.     

Identification of an aliphatic epoxide and the corresponding dihydrodiol as novel congeners of zearalenone in cultures of Fusarium graminearum

The mycotoxin zearalenone (ZEN) is produced by various Fusarium fungi and frequently found as a contaminant in food and feed. There are reports in the literature that several closely related analogues of ZEN are also formed in cultures of Fusarium species. We have therefore analyzed the organic extract from a 40 day culture of Fusarium graminearum by LC-DAD-MS and detected 15 compounds, which could be congeners of ZEN because of their ultraviolet, mass spectroscopy, and tandem mass spectroscopy spectra. In addition to confirming the previously reported α- and β-stereoisomers of 5-hydroxy-ZEN and 10-hydroxy-ZEN, we identified seven ZEN congeners for the first time. One of the major novel congeners was shown by nuclear magnetic resonance spectroscopy and chemical synthesis to have the structure of an aliphatic ZEN epoxide, whereas two minor products proved to be the corresponding dihydrodiols. In addition, three stereoisomers of a cyclization product of the dihydrodiols, carrying a spiro-acetal group, were identified as fungal products for the first time. The latter may be artifacts, because the ZEN epoxide and dihydrodiol are unstable under acidic conditions and rearrange easily to the spiro-acetal compounds.     

STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况,并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明,转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后,细胞增殖能力增强,染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代,表明导入STAT3基因后,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。     

杆状病毒AcMNPV orf59基因的克隆表达、抗体制备及亚细胞定位

用PCR方法从苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）基因组中扩增到orf59基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建pET-Ac59质粒,再将该质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为30kDa的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞（Sf9）中orf59基因的表达,结果显示：在感染后的细胞中有两条分子量分别约为38kDa和25kDa蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现：在病毒感染的晚期,Ac59蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。这些研究为下一步深入进行Ac59功能的研究奠定了一定的基础。