柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22单克隆抗体的制备与鉴定

旨在制备毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)配子体抗原EnGAM22单克隆抗体,用Ni-NTA亲和层析纯化的重组抗原rEnGAM22免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用预先建立的ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行4次亚克隆后,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株并命名为2F3和3D3;对单抗亚类和特异性进行鉴定,应用单抗识别天然蛋白和虫体定位。结果显示,单克隆抗体2F3和3D3亚类分别为IgG2a、IgG2b,纯化后腹水效价分别为1:256 000、1:64 000,能特异性识别重组抗原rEnGAM22和毒害艾美耳球虫天然配子体蛋白;免疫荧光定位显示单克隆抗体2F3和3D3能特异性识别大配子体的成壁体和卵囊壁,表明EnGAM22抗原参与卵囊壁的形成。制备的单克隆抗体为研究球虫卵囊壁形成的分子机制奠定了基础。     

雏鸡感染毒害艾美耳球虫后的体液免疫

采用SPA菌体花环法、间接ELISA法和免疫组织化学法检测毒害艾美耳球虫（E．necatrix）感染雏鸡后，其血液免疫球蛋白含量、B细胞和免疫器官抗体生成细胞数量的动态变化。结果发现：①E．necatrix感染雏鸡后10d血液B细胞数量和IgG、IgM、IgA含量均开始增加，16～18d达到峰值；②感染雏鸡法氏囊、脾脏等免疫器官的抗体生成细胞数量于7～21d不同程度增加，14～18d达最高峰。结果表明，雏鸡体液免疫在抵抗E．necatrix感染中也发挥重要作用。     

毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊壁的分离与纯化

用毒害艾美耳球虫孢子化卵囊接种50只15日龄无球虫感染的雏鸡,感染后第6~12天,每隔12 h收集1次粪便,按常规方法分离卵囊。未孢子化卵囊经次氯酸钠溶液处理后,用1.1 mol/L蔗糖溶液漂浮法纯化卵囊。采用玻璃珠涡旋法破碎卵囊壁,最后用孔径10.0μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜过滤获得纯化的卵囊壁。研究结果为进一步研究毒害艾美耳球虫卵囊壁的结构及其蛋白组成奠定了基础。     

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测.结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效.然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组.综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的.     

毒害艾美耳球虫鸡胚培养研究

为了建立毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的鸡胚培养体系,用毒害艾美耳球虫子孢子分别接种8～11日龄鸡胚以确定最佳接种日龄,用不同剂量子孢子接种同一日龄鸡胚以确定最佳子孢子接种剂量,并在子孢子混悬液中分别加入不同剂量的胰岛素和叶酸以观察对球虫在鸡胚中发育的影响.结果显示,毒害艾美耳球虫子孢子接种9日龄的鸡胚,其卵囊产量(平均每只胚的卵囊量)和卵囊成熟率均为最高,成熟率达到99%;当每个鸡胚接种子孢子1×104个时,其卵囊产量最高;在子孢子混悬液中分别加入胰岛素1 000 U/mL、叶酸0.05 mg/mL,均能明显增加鸡胚中的卵囊产量.本文通过对毒害艾美耳球虫的鸡胚接种日龄、子孢子接种剂量、营养物质添加等因素的研究,初步建立了毒害艾美耳球虫的鸡胚培养体系.     

毒害艾美耳球虫晚熟系选育及其生活史研究

以剂量为l200～20000个孢子化卵囊／羽的毒害艾美耳球虫(E．necatrix)北京株(中熟系)感染3日龄京星黄羽肉仔鸡，收集感染后第11天粪便中卵囊，孢子化后接种无球虫鸡进行连续传代，经传代16次后，发现其排卵囊高峰较母株(中熟系)推迟了2天，即由接种后第7天推迟到第9天，且连续3代排卵囊高峰均出现在第9天，有较好的稳定性。生活史研究表明，其各阶段虫体均比母株的大，但潜在期不变，推测可能是选育得到的晚熟系卵囊中尚含有少量中熟系卵囊的缘故。     

毒害艾美耳球虫配子体gam22基因的克隆与序列分析

提取毒害艾美耳球虫(En)配子体总RNA,应用RT-PCR进行gam22基因的克隆,测序后对其进行序列分析。结果表明,Engam22基因全长为713 bp,其中包含一个完整的开放阅读框,大小为561 bp,编码186个氨基酸,含有一个富含组氨酸和脯氨酸的特征性结构域;与柔嫩艾美耳球虫(Et)配子体Etgam22基因序列进行比对,同源性为97.7%。此配子体蛋白基因具有较高的保守性,可以作为抗球虫疫苗的候选基因。     

鸡胚接种毒害艾美耳球虫Eimeria necatrix的免疫研究

给15、17、19日胚龄的鸡胚经羊膜腔分别接种不同剂量的毒害艾美耳球虫Eimeria necatrix孢子化卵囊、孢子囊或子孢子,出雏后在无球虫环境中笼养,收集2~7日龄间全部粪便,以饱和盐水漂浮法检查卵囊的产生,并于17日龄时以1.2×105个/鸡的同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、病变计分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果表明,孢子化卵囊、孢子囊或子孢子经羊膜腔免疫接种后对鸡胚的孵化率无明显影响,所有接种组在出雏后2~7日龄间均能检获后代卵囊,攻虫后各免疫组的相对增重率由攻虫对照的38%~42.9%提高到73.2%~90.5%,病变计分减少率达50%~74.9%,相对卵囊产量为攻虫对照组的28.1%~60.2%,表明以一定剂量的E.necatrix孢子化卵囊、孢子囊或子孢子经羊膜腔免疫接种鸡胚,可诱导鸡在出雏后笼养条件下对同源艾美耳球虫的免疫保护力;比较不同剂量、不同胚龄的免疫效果,发现在试验设定条件下于17日胚龄接种8×104个子孢子/胚的效果最好。     

饲料添加中草药抗毒害艾美耳球虫效果观察

选择90只1日龄蛋用公雏,随机分为6组:马杜毒素拌料组(Ⅰ组,添加量5 mg/kg饲料),克球粉拌料组(Ⅱ组,添加量125 mg/kg饲料),中草药处方①组(Ⅲ组,添加量10 000 mg/kg饲料),中草药处方②组(Ⅳ组,添加量10 000 mg/kg饲料),感染不给药组(V组),不感染不给药组(Ⅵ组).于无球虫条件下进行饲养,从1日龄起饲喂混有药物的饲料,除Ⅵ组外,其他各组在18日龄接种1×105个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊,根据各组存活率、相对增重率、病变记分、血便记分和抗球虫指数观察药物的疗效,结果表明:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组有低效抗球虫作用,Ⅲ组有中效抗球虫作用.     

毒害艾美耳球虫早熟株与亲本株繁殖力的观察

为选育毒害艾美耳球虫(E.necatri)早熟株,了解其繁殖力,为早熟弱毒活苗的研制奠定基础,本试验运用球虫的单卵囊分离技术得到一株E.necatrix(P0),并对其进行了早熟选育,得到了E.necatrix早熟株P8。P0和P8分别以0.05×104、0.1×104、0.5×104和1×104个/只的剂量接种11日龄雏鸡,接种后第7～13天每天检测粪便中的卵囊产量。结果表明,P0与P8均为接种0.5×104个/只的卵囊产量最大;P8的繁殖力是P0的55%;P8的卵囊高峰期较P0有提前趋势。     

毒害艾美耳球虫晚熟系生物学特性研究

本文对毒害艾美耳球虫晚熟系基本生物学特性进行了研究。结果表明，晚熟系的致病性与同等剂量中熟系的相当；繁殖能力高于中熟系，且每羽鸡的排卵囊总量与剂量成正相关，每个卵囊的繁殖能力与剂量成负相关；在同等剂量免疫下，晚熟系的免疫原性好于中熟系；2次免疫后，晚熟系免疫组的保护力与中熟系的相当，攻虫后卵囊繁殖减少率均在99％以上。     

毒害艾美耳球虫纯种卵囊收集鉴定及致病性测定

鸡球虫是养鸡业的一大疾病 ,严重阻碍着我国养鸡业的发展。在各种鸡病中 ,球虫病的发生率最高 ,占 1 /6～ 1 /5。Rose和 Long( 1 980 )报道英国养禽业因球虫病每年损失 5 5 0万英镑 ,其中一半是药物费用 ;在美国损失可能达到 5 0 0 0万英镑。 Rose和Long( 1 985 )保守地估计全世界养禽业每年球虫造成的损失为 5亿美元左右 ,其中 2 .5亿美元用于药费支出 [1]。中国是养鸡大国 ,养鸡数量居世界之首 ,但由于集约化程度低 ,饲养环境差 ,保健系统不完善因素的影响 ,球虫病所造成的损失 ,可能高于世界平均水平。球虫病所造成的经济损失至少 5 0 …     

毒害艾美耳球虫山西株的分离和鉴定

为了鉴定造成太谷区某鸡场57日龄蛋鸡死亡的鸡球虫种类,明确其生物学特性,本试验采用饱和食盐水漂浮法和单卵囊分离技术从病死鸡粪便中分离纯化得到1株球虫;将分离球虫口服接种SPF鸡,观察并测定卵囊最短孢子化时间、裂殖体寄生部位和大小、卵囊寄生部位和大小、潜隐期、死亡率、增重情况、肠道病变记分等指标,了解该虫株的生物学特点并初步鉴定其类型,随后采用序列特征性扩增区域(SCAR)标记技术进一步确定虫株类型。结果显示,分离虫株的裂殖体寄生于空肠,平均大小为(63.17±7.66)μm×(47.12±6.91)μm,卵囊仅盲肠可见,平均大小为(19.92±0.20)μm×(19.27±0.11)μm,虫株潜隐期为152 h,最短孢子化时间为18 h,接种5.0×10⁴个卵囊/羽和1.1×10⁵个卵囊/羽的分离虫株可分别造成40%和50%的实验鸡死亡,相对增重率下降至31.61%和20.87%,病变记分分别达到3.9和4.0;SCAR标记扩增显示,分离虫株与毒害艾美耳球虫(E.necatrix)的同源性达97.1%,命名为E.necatrix-CN-SX-...     

毒害艾美耳球虫-田间分离株的致病性试验

毒害艾美耳球虫扬州田间分离株以不同的剂量(10 000,30 000,50 000,70 000,90 000个卵囊/羽)感染28日龄黄羽肉雏鸡,以平均增重、死亡率、病变记分等指标评价其致病性。结果显示,除10 000个卵囊组外,其余4个剂量组均显著影响增重(P<0.05),并引起鸡的死亡,死亡率分别为37.5%～50%、37.5%～50%、62.5%、75%～87.5%;各感染组均出现肠道病变,其中10 000个卵囊组的病变值显著小于其余4个剂量组(P<0.05),但与不感染对照组相比有显著差异(P<0.05)。结论表明,该毒害艾美耳球虫田间分离株有很强的致病性。     

巨型艾美耳球虫配子体GAM56基因的克隆与表达

目前报道的鸡球虫有7个种,其中巨型艾美耳球虫具有较强的致病性,而且是鸡体内致病性球虫中免疫原性最强的球虫,只需要几个卵囊就可以产生较好的保护能力[1]。后来的研究也发现用纯化的巨型艾美耳球虫配子体抗原免疫的鸡可产生明显的保护性抗体,最重要的是这种抗体可作为母源抗体传递给子代,对子代产生几乎完全的保护力,并可持续3个月之久[2-4]。而且,使用巨型艾美耳球虫进行免疫可以对其他种类球虫产生交叉保护力[5]。本课题组曾对柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫进行功能抗原基因的克隆、表达和抗原性研究,取得了较好的结果。本研究克隆出…     

毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重PCR检测方法的建立

旨在初步建立可同时检测毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的双重PCR及纳米PCR检测方法。基于E.necatrix的ITS-2基因和C.perfringens的α毒素基因分别设计、筛选靶基因位点的特异性扩增引物,通过反应体系和退火温度的优化,建立适用于两种病原的特异性双重PCR和双重纳米PCR检测方法;用所建立的方法对6种其它常见寄生性原虫和3种其他细菌进行PCR扩增以验证其特异性;构建两种病原的重组质粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa,将其按10倍倍比稀释成不同浓度梯度的质粒模板用于所建方法的敏感性试验。结果表明：两种方法均能特异性扩增出E.necatrix约150 bp和C.perfringens约400 bp的目的片段,且所建立的两种检测方法对其他6种其他原虫和3种其他细菌的检测结果均为阴性;双重PCR扩增E.necatrix和C.perfringens的最低模板检出量分别是181和1 050 copies,而双重纳米PCR的最低模板检出量分别是1.81和105 copies;临床检测...     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

毒害艾美球虫纯种分离的初步鉴定和致病性研究

采用从寄生部位分离和单卵囊感染技术,对现场采集的鸡球虫混合种进行单种纯化,获得了毒害艾美球虫(Eimeria necatrix)。该种卵囊呈卵圆形,经测240个卵囊,平均为19.06±1.54×16.50±1.26 μm,形状指数1.16。测120个孢子囊,平均为11.27±0.70×6.21±0.51μm。无卵囊残体和孢子囊残体,未观察到卵膜孔和极帽。最短孢予化时间为19小时,感染后最早排出时间143小时,最大裂殖体68.75×66.25μm。用此卵囊1万、5万、10万和20万个分别感染10日龄伊莎公鸡,结果感染5～20万个卵囊组的死亡率为41.67～50.00％,感染组的肠道病变记分为1.33、3.42、3.67和3.83,其平均增重与不感染对照组差异极显著(P<0.01)。E.necatrix对鸡致病性很强,在生产上需高度重视,做好预防工作。     

毒害艾美耳球虫初次感染对雏鸡外周血液免疫功能的影响

应用免疫SPA菌体花环、间接ELISA及细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)测定法对毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)初次感染雏鸡外周血液的T、B细胞数量及其对ConA或PMA的增殖功能和IgG、IgM、IgA含量的动态变化进行了较全面系统的研究。结果发现,E.necatrix初次感染雏鸡外周血液的T、B细胞数量及其相应增殖功能、血清中上述三种免疫球蛋白含量均不同程度地高于未感染的对照雏鸡,表明E.necatrix初次感染雏鸡外周血液的细胞免疫和体液免疫功能均明显提高。