猪布鲁菌S2omp10基因缺失株的构建及特性

现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷.本研究利用同源重组的方法,得到了布鲁菌S2株omp10基因缺失株.分别用基因缺失株和疫苗株感染小鼠,比较基因缺失株小鼠体内的存活能力.结果成功构建了布鲁菌S2株omp10基因缺失株,动物试验结果表明,基因缺失株仍能在小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.与原始S2株比较,基因缺失株的感染力进一步减弱.表明omp10基因在布鲁菌的毒力及体内生存方面发挥了作用,为基因标记疫苗的研制奠定了基础.     

布鲁菌病活疫苗菌体高密度发酵工艺研究

在GMP原则的指导下,为了提高布鲁菌病活疫苗的产量和头份数,在500L发酵罐基础上,对布鲁菌S2株的菌体高密度发酵工艺进行了一系列优化试验,各项发酵培养条件经优化后,菌体的密度得到了明显提高,发酵菌数可达到300亿CFU/mL以上。     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

布鲁菌基因缺失疫苗侯选株研究进展

布鲁菌病是由布鲁菌引起的人兽共患传染病,接种疫苗是预防和控制该病最有效的方法之一。目前国内外使用的疫苗主要是减毒活疫苗,这种活疫苗具有一定的毒力,但不能区分野毒感染与疫苗免疫产生的抗体,会干扰该病的检疫,国内外许多研究者致力于基因缺失标记疫苗。论文综述了近年来布鲁菌基因缺失疫苗株的研究及应用概况,以加深对布鲁菌病新型疫苗的认识。     

布氏菌病活疫苗活菌计数项目能力验证结果分析

为了解全国布氏菌病活疫苗生产企业活菌计数能力,2015年对该项目进行了能力验证分析,每名参比企业发放布氏菌活疫苗(S2株)样品3份,要求在规定时间内对其进行活菌计数并提交结果报告。结果显示,参比的17家企业中,15家结果"满意",2家企业结果"不满意",表明全国大部分布氏菌病活疫苗生产企业具备可信任的布氏菌病活疫苗活菌计数检测能力。     

布鲁菌病活疫苗M5株在羊的免疫中面临的问题及对策

<正>近年来,随着甘州区牛羊产业的快速发展,活畜调运频繁,布鲁菌病在局部乡镇出现明显反弹,威胁到当地养殖业的安全和人民身体的健康,甘州区畜牧兽医工作站在2015年的该病抽样检测中,羊的发病率为2.2%,已超过了国家的控制标准。为此,按照甘肃省防制重大动物疫病指挥部的要求,2016年春季在我区的平山湖和靖安两个乡进行布鲁菌病活疫苗M5株的免疫试点,现将我区在羊布鲁菌病活疫苗M5株免疫中的一些做法报道如下,     

牛布鲁菌强毒株544与猪型疫苗株S2基因组差异筛选与鉴定

应用代表性差异分析技术(Representational difference analysis,RDA)对流产布鲁菌强毒株544和疫苗株S2进行基因组差异分析。经过3轮差减杂交,对差异片段进行Southern-blot验证,BLAST分析和PCR鉴定,最终获得疫苗株S2特有的3条差异片段与已测序的所有猪布鲁菌(Brucella suis)同源性均为100%,只在弱毒株S2基因组中检测出,而在强毒株544中不存在,为建立布鲁菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础。     

布鲁菌铁转录调控因子rirA基因突变株的构建与鉴定

为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

布氏杆菌病活疫苗(S2)不同接种方法免疫效果观察

布氏杆菌病活疫苗(S2株)系用猪种布氏杆菌S2株(CVCC 70502)接种适宜培养基培养,收获培养物,加适宜稳定剂,经冷冻真空干燥制成.它作为活菌苗具有使用范围广和使用方便的特点.可供猪、牛、山羊和绵羊等多种动物免疫使用,可以使用皮下或肌肉注射、口服免疫多种方法接种.为了测试布氏杆菌病活疫苗(S2)不同接种方法的实际免疫效果,特以绵羊为例进行了临床试验观察,现报告如下.     

呼和浩特地区牛羊布鲁菌流行株种及生物型鉴定

应用常规细菌学方法,对呼和浩特部分地区疑似布鲁菌病的牛、羊流产胎儿病料进行了布鲁菌分离,共分离到4株布鲁菌.进一步根据细菌形态、培养特性、生化特性以及平板凝集试验等对分离到的细菌进行种型鉴定.结果表明,其中3株为羊种布鲁菌生物3型,1株为牛种布鲁菌生物3型.本研究结果为内蒙古地区布鲁菌病的防控奠定了病原学基础.     

基于HOOF-Prints技术的布鲁菌疫苗株基因序列遗传变异分析

通过分析布鲁菌疫苗株基因序列遗传变异情况,为疫苗的免疫保护力的评价提供理论依据,本研究利用高变量八聚物寡核苷酸指纹技术(HOOF-Prints)对国内主要布鲁菌疫苗-羊种布鲁菌疫苗M5、猪种布鲁菌疫苗S2、牛种布鲁菌疫苗S19、人用布鲁菌疫苗104M进行序列分析,并基于布鲁菌标准参考株采用软件DNAMAN进行系统进化树分析。结果表明4种疫苗株的基因序列均发生了变异,但系统进化树分析显示这些疫苗株与对应的参考株遗传关系仍然最近,同时表明该指纹技术在分子水平上可以用于分析和了解国内主要疫苗的变异情况,为疫苗的免疫效果提供理论依据。     

布鲁菌S2疫苗株的核酸探针检测方法的建立

为了鉴别布鲁菌疫苗免疫和自然感染,建立鉴别布鲁菌S2疫苗株与其他菌株的斑点杂交法。针对布鲁菌基因序列保守区S2疫苗株与其他菌株的差异设计探针,同时根据差异部分设计引物进行PCR扩增;PCR产物经过回收、纯化、变性后固定在NC膜上,与探针杂交、显色。结果显示,PCR引物能够对S2疫苗株扩增出约330bp的核酸片段,对其他布鲁菌扩增出约360bp的核酸片段;探针只能和S2疫苗株的PCR产物杂交,最低检测到10pg DNA,能够在10h内鉴别出布鲁菌S2疫苗株。     

流产布鲁菌LysR家族转录调控子LTTR8缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原,兼性胞内寄生,无典型毒力因子,毒力相关基因的研究对阐明布鲁菌持续感染的机制具有重要意义。本研究以流产布鲁菌S2308为亲本株,通过同源重组的方法,构建流产布鲁菌LysR家族转录调控子基因bab＿RS24670缺失株ΔlttR8,基于广宿主质粒pBBR1MCS构建成互补株ΔlttR8-Com。免疫印迹试验表明：ΔlttR8为光滑型菌株;体外培养分析发现lttR8缺失不影响布鲁菌的生长;细胞感染试验发现lttR8缺失不影响布鲁菌黏附、入侵细胞和胞内存活的能力。耐受性试验分析发现：lttR8缺失不影响布鲁菌对过氧化氢（H2O2）和多粘菌素B(polymyxin B)的敏感性。小鼠感染试验分析发现lttR8缺失显著减弱流产布鲁菌的毒力。综上所述,本研究发现一个新的与流产布鲁菌致病性相关的转录调控子,为布鲁菌致病机制研究提供参考。     

基于VNTR技术对布鲁菌的基因多态性研究

应用15个VNTR位点对我国保存的19株布鲁菌标准株和4株减毒活疫苗以及松源地区10株临床分离株进行基因多态性研究。采用15个VNTR位点对33株布鲁菌进行PCR扩增,产物进行琼脂糖电泳,根据产物大小计算序列重复数,据此分析菌株的遗传多态性。建立了15个VNTR位点的琼脂糖凝胶电泳及拷贝数计算分析方法,应用该技术分析了33株布鲁菌的遗传多态性。结果表明这15个位点能较好地区分不同种型或亚型以及减毒活疫苗株,同时也为临床株的分型提供了依据。     

呼和浩特地区奶牛流产胎儿中布鲁菌的分离鉴定

布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)引起的一种世界范围内的人兽共患传染病,给畜牧业发展带来重大的经济损失。控制布鲁菌病的传播,减少其对人类健康和畜牧业发展的危害已经成为当前亟需解决的问题。该文采用细菌学检验手段,对呼和浩特地区出现流产、早产、死胎、胎盘滞留等疑似布鲁菌病现象的奶牛进行病料采集,并对其进行细菌学分离与鉴定,结果获取了5株布鲁菌菌株,表明该地区存在布鲁菌病。该结果为今后呼和浩特市采取有效措施控制布鲁菌病的流行、蔓延提供了科学依据。     

奶牛布鲁菌病血清学调查及病原分离鉴定

2015—2016年应用虎红平板凝集试验、试管凝集试验对新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州21个奶牛场、503个奶牛养殖户所饲养的奶牛进行了布鲁菌病血清学调查,虎红平板凝集试验阳性率为1.10%,试管凝集试验阳性率为0.82%。对2013—2016年4年内在该地区收集的奶牛流产胎儿、胎衣、阴道分泌物等243份病料进行布鲁菌的分离鉴定,结果分离出2株羊种2型布鲁菌和2株牛种3型布鲁菌。血清学调查及布鲁菌分离鉴定结果佐证了在该地区存在布鲁菌病,建议奶牛养殖场（户）和有关部门切实做好布鲁菌病的检疫及防控工作。     

山羊流产胎儿绵羊附睾种布鲁菌(Brucella ovis)的分离和鉴定

从山羊流产胎儿中分离出1株绵羊附睾种布鲁菌(Brucella ovis),经培养发现该菌需要CO2,不产生H2S,且经硫堇、碱性复红和A、M、R因子血清凝集试验及噬菌体裂解试验等方法鉴定,该菌株与国际标准菌株绵羊附睾种特性完全一致。在山羊中分离出绵羊附睾种布鲁菌株(Br.ovis)在国内尚属首次发现。     

表达Omp31基因重组牛布鲁菌的构建及鉴定

为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。     

荧光定量PCR技术检测布鲁菌BMEⅡ0042基因在酸压力下的表达

[目的]为研究热激蛋白在布鲁菌酸压力条件下发挥的作用,对其编码基因之一的BMEⅡ0042基因在酸压力条件下的表达情况进行检测。[方法]提取正常培养条件下及酸性培养条件下布鲁菌16M株总RNA,先将其反转录为cDNA,再利用荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测布鲁菌热激蛋白编码基因BMEⅡ0042在酸压力下的表达情况。[结果]在酸性条件下,布鲁菌BMEⅡ0042基因相对表达量为16S rDNA的6.20倍,表明该基因表达上调。[结论]布鲁菌热激蛋白编码基因BMEⅡ0042在酸压力条件下上调表达,为进一步研究热激蛋白在布鲁菌酸调控网络中发挥的作用奠定了基础。