高低温胁迫对番茄叶片抗坏血酸代谢系统的影响

为探明番茄在温度逆境下抗坏血酸（AsA）代谢系统抗氧化的生理机制,以番茄幼苗为试材,分别研究了高温（40℃）和低温（5℃）胁迫（0、4、8、12、24、36h）下,叶片AsA代谢的主要酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性与AsA、脱氢抗坏血酸（DHA）和AsA＋DHA含量的变化。结果表明：在高温和低温胁迫下,除36h外,番茄叶片AsA、DHA和AsA＋DHA含量和GalLDH、DHAR、APX、MDHAR及GR活性均明显高于25℃（CK）处理,H2O2含量始终明显高于CK,AsA／DHA始终明显低于CK,说明短时间（24h）高温和低温胁迫,番茄幼苗以AsA为核心的抗氧化系统功能明显增强,但长时间（36h）温度胁迫,AsA抗氧化系统的功能明显下降,导致H2O2的积累。     

短期温度胁迫对西葫芦叶片抗坏血酸代谢系统的影响

为了研究西葫芦叶片面对短期温度胁迫时抗坏血酸代谢系统的变化情况,以西葫芦'德绿808'为试材,利用盆栽试验,通过光照培养箱设置低温(12℃/12℃,T1)和高温(38℃/38℃,T2)进行试验处理。结果表明:T1和T2胁迫显著增加了西葫芦幼苗叶片MDA含量、O_2~-·产生速率和H_2O_2含量,AsA(还原型抗坏血酸)、DHA(氧化型抗坏血酸)和AsA+DHA含量,GSH(还原型谷胱甘肽)、GSSG(氧化型谷胱甘肽)和GSH+GSSG含量,常温恢复后下降但仍高于对照。T1和T2处理下AsA/DHA和GSH/GSSG呈下降趋势,常温恢复后有回升但仍低于对照。T1和T2处理导致抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性明显升高,温度恢复后下降但仍高于对照。在整个胁迫期间,T2处理的以上指标均高于T1处理的,说明高温对西葫芦的伤害高于后者。以上结果说明在温度胁迫初期,西葫芦叶片以AsA为核心的抗氧化系统对抵御高温和低温胁迫发挥了重要作用,但是随着胁迫时间的延长,AsA代谢系统的抗氧化功能逐渐降低。     

土壤紧实胁迫对黄瓜抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响

【目的】探索土壤紧实胁迫对黄瓜产生伤害的机理,为土壤的可持续利用提供参考。【方法】用容重为1.20 g•cm-3的疏松土壤和1.55 g•cm-3的紧实土壤进行盆栽试验,研究土壤紧实胁迫对‘津春4号’黄瓜叶片及根系中抗坏血酸-谷胱甘肽循环（AsA-GSH）的影响。【结果】在土壤紧实胁迫条件下,黄瓜叶片及根系中过氧化氢（H2O2）含量和丙二醛（MDA）含量显著提高,且根系中两种物质的增幅高于叶片,表明根系的伤害程度高于叶片。与此同时,叶片及根系中还原型抗坏血酸（AsA）含量、AsA+DHA量、ASA/DHA显著降低,脱氢抗坏血酸（DHA）含量显著提高;还原型谷胱甘肽（GSH）含量显著下降,氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量、GSSG/GSH比值显著提高,GSSG+GSH变化甚微,表明AsA及GSH被消耗以清除H2O2。叶片及根系中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性显著升高,且APX的活性水平远远高于MDHAR、DHAR及GR,表明APX在清除H2O2的过程中氧化AsA的能力远远高于MDHAR和DHAR再生AsA的能力及GR将GSSG还原成GSH的能力。【结论】在土壤紧实胁迫条件下,黄瓜秧苗（叶片及根系）中的AsA-GSH循环加强,削弱了土壤紧实胁迫造成的伤害。     

烟草液泡转化酶抑制子基因调控马铃薯块茎低温还原糖累积的研究

【目的】克隆烟草液泡转化酶抑制子基因，并在马铃薯中表达，从而抑制低温贮藏块茎还原糖积累，提高马铃薯加工品质。【方法】通过RT-PCR法分离Nt-VIF全长cDNA，转化马铃薯植株，PCR、Northern杂交和Southern杂交检测转基因植株，转基因植株块茎在低温和常温条件下贮藏30 d，分析转化酶活性与还原糖含量。【结果】克隆到Nt-VIF全长cDNA，35S调控下正向的Nt-VIF基因cDNA已经成功转入鄂马铃薯3号（E3）植株。转基因植株块茎在4℃和20℃贮藏30 d表明，VI活性受温度调节，高温贮藏块茎的VI活性显著低于低温贮藏的块茎，且高温条件下转基因块茎与对照无显著差异，而低温条件下转基因块茎的VI活性与对照相比下降幅度为22.7%（株系A-3）～78.1%（株系A-31）。转基因块茎还原糖（RS）含量在高温贮藏条件下与对照差异亦不明显，而低温贮藏条件下RS含量下降幅度为20%（株系A-17）～80.5%（株系A-30）。进一步分析还表明，转基因块茎低温贮藏其液泡转化酶活性与还原糖含量呈显著正直线相关（RS = 0.289VI + 0.0736）。【结论】Nt-VIF基因的表达显著抑制了马铃薯液泡转化酶活性，导致还原糖积累降低。     

转番茄正义抗坏血酸过氧化物酶基因提高烟草耐盐能力

 【目的】探讨叶绿体类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶（tAPX）与耐盐性的关系。【方法】从番茄叶片中分离到类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因（LetAPX）,利用农杆菌介导的叶盘法转入到烟草中。Northern 杂交分析了LetAPX在盐胁迫（NaCl）下的表达特征。以野生型（WT）,转正义LetAPX烟草株系T2-2（+）和T2-6（+）为试材,测定了盐胁迫条件下APX酶活性,过氧化氢（H2O2）含量,种子发芽率,植株的鲜重、干重,光合速率及叶绿素荧光参数。【结果】Northern杂交显示LetAPX已转到烟草基因组中,且基因的表达受盐胁迫的诱导。盐胁迫下转基因烟草的种子发芽率,植株的鲜重与干重,APX酶活性和清除H2O2的能力都显著高于野生型,并且转基因烟草比野生型具有更高的净光合速率（Pn）和PSII最大光化学效率（Fv/Fm）。【结论】LetAPX的过量表达有助于提高烟草的耐盐能力。     

超表达小麦基因TaSOD1.1和TaSOD1.2对烟草耐低温能力的影响

 【目的】研究超表达小麦基因TaSOD1.1和TaSOD1.2对烟草耐低温能力的影响。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合靶基因的转基因烟草植株;通过比较低温处理后对照和转基因系的表型和生理指标,鉴定超表达靶基因对烟草耐低温能力的调控效应。【结果】以分子检测鉴定的插入单拷贝基因的4个转基因系和对照为材料,低温处理后超表达外源基因的转基因植株叶片失绿缓慢,叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增加,反映细胞膜质过氧化程度的丙二醛（MDA）含量明显下降;叶片叶绿素a、b和类胡萝卜素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均明显提高。【结论】超表达小麦TaSOD1.1和TaSOD1.2的烟草植株,具有增强SOD活性、明显缓解低温造成的细胞膜质过氧化程度、改善低温胁迫下植株的生理功能,可进而改善植株抵御低温胁迫的能力。     

棉花亲环素基因GhCYP1的功能分析

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。     

基于云南主栽马铃薯品种抗氧化防御系统对干旱胁迫的响应研究

【目的】探明干旱胁迫下,云南省主栽马铃薯品种合作88号、丽薯6号、青薯9号和宣薯2号抗氧化系统的生理响应机制,为抗旱马铃薯品种筛选及抗旱栽培与育种提供理论依据。【方法】采用人工模拟干旱胁迫的方式,研究干旱胁迫对马铃薯叶片抗氧化防御系统的影响。设置PEG6000浓度0%(CK)、15%、20%、25%和30%5个处理,测定不同处理后马铃薯叶片中的过氧化氢(H_2O_2)、可溶性蛋白(SP)、类胡萝卜素(Car)、还原型抗坏血酸(AsA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽还原酶(GR)含量。【结果】干旱胁迫下,合作88号、丽薯6号、青薯9号和宣薯2号4个品种均对干旱胁迫作出响应,随干旱胁迫程度增加,4个马铃薯品种中过氧化氢含量呈上升趋势,合作88号过氧化氢(H_2O_2)积累量最大。在干旱胁迫条件下,4个马铃薯品种SP、AsA、GSH、APX、DHAR和GR、Car含量均显著高于对照(PEG6000浓度0%),其中PEG6000浓度为25%时,马铃薯叶片抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)活性达峰值,而类胡萝卜素(Car)含量在30%浓度胁迫下酶活达峰值, APX、DHAR在PEG浓度20%时含量最高。【结论】马铃薯可通过抗氧化的酶促及非酶促系统的协同作用来清除活性氧,4个主栽马铃薯品种中,合作88号抗氧化防御系统对干旱胁迫的响应程度较其他品种强。     

MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成

【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能,特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄（AC）中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料,设置正常供磷（+Pi,MS+KH₂PO₄ 3.4 g·L^-1）和缺磷（-Pi,MS+KCl 1.86 g·L^-1）2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后,观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异,通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like（SGN-U320618）和花青素合成相关酶基因（PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H）的表达模式,应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用,且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间,从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高,在LA1996中的表达最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高,在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反,证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下,野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高;miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%-60%,花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下,野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达;转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄;转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅;转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株;miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下,miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达,进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。     

外源褪黑素对低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶活性和AsA-GSH循环的影响

利用叶面喷施方法,探讨100μmol/L外施褪黑素(MEL)溶液对低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶系统和抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH循环)的影响,以此推论MEL在葡萄受到低温胁迫时起到的作用.结果表明,外源MEL可以促进低温胁迫下葡萄抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量的积累,降低GSSG含量.长时间(7 h)低温胁迫下,外源MEL可以降低脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)含量,能够维持较高的AsA-GSH循环系统中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、DHAR、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性.喷施外源MEL促进了低温胁迫下葡萄AsA-GSH循环快速而有效的运转,降低了低温胁迫对葡萄植株的氧化伤害,从而缓解了低温胁迫对葡萄幼苗的伤害作用.     

Over-Expression of Tomato GDP-Mannose Pyrophosphorylase （GMPase） in Potato Increases Ascorbate Content and Delays Plant Senescence

GDP-D-mannose pyrophosphorylase (GMPase) catalyses the synthesis of GDP-D-mannose and represents the first committed step in the synthesis of ascorbate. In the present study, the GMPase gene of tomato was introduced into potato by Agrobacterium-mediated transformation. Two transgenic lines with higher GMPase expression were selected using qPCR and protein blot analyses. The results showed that the content of L-ascorbic acid (AsA) and the ratio of AsA/DHA (dehydroascorbate) significantly increased in both leaves and tubers of transgenic potato plants. Both pigment content and photosynthetic rate were much higher in transgenic plants than in wild-type plants. Transgenic plants showed a distinguishable change in phenotype from the wild-type plants. Furthermore, transgenic plants showed delayed senescence.     

拟南芥AtCOR15a转化烟草及后代抗寒性研究

【目的】研究拟南芥AtCOR15a基因的抗寒功能。【方法】构建pCAMBIA1301-COR15a的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过抗生素筛选和PCR检测获得转基因烟草。低温胁迫后,利用蒽酮法和酸式茚三酮法测定转基因烟草后代与野生型烟草的可溶性糖和脯氨酸含量,同时观察其抗寒能力。【结果】转基因烟草后代可溶性糖含量和脯氨酸含量均比野生型烟草有所提高,并在第5 d达到峰值。低温处理后转基因烟草后代能正常生长,而野生型烟草则全部死亡。【结论】生理生化指标的测定发现,可溶性糖含量与脯氨酸含量的变化趋势与烟草的抗寒性呈正相关,AtCOR15a基因导入烟草中可以明显提高烟草对低温胁迫的抵抗力。     

黑穗醋栗果实生长发育过程中抗坏血酸含量 及相关酶活性的变化

【目的】 研究不同品种不同生长时期黑穗醋栗果实内抗坏血酸（AsA）含量及其合成代谢过程中相关酶活性的变化,以明确果实生长发育过程中AsA含量与代谢合成相关酶之间的关系,为全面揭示黑穗醋栗果实AsA积累规律提供理论依据。【方法】 以3个不同黑穗醋栗品种（‘亚德’‘布劳德’和‘黑丰’）为试材,测定果实在幼果期、膨大期、半转色期、转色期和成熟期时还原型抗坏血酸（AsA）、氧化型抗坏血酸（DHA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及AsA合成与代谢相关酶活性。【结果】 不同品种黑穗醋栗果实大小、AsA含量以及AsA相关代谢物水平存在明显的多样性。其中‘亚德’单果重最大,为1.97 g。果实生长发育过程中,总抗坏血酸（T-AsA）和AsA含量在3个品种中变化趋势一致,均在幼果期含量最高,其中‘亚德’幼果期果实中AsA含量最高,为83.17 μmol·g ^-1 FW,随着果实的生长迅速下降,在成熟期降至21.28 μmol·g ^-1 FW;3个品种果实中GSH和T-GSH含量随着果实发育呈升高趋势,但不同品种升高时期或增加幅度不同;GSSG含量在不同品种间存在较大差异,成熟果中‘黑丰’含量最低,为0.008 μmol·g ^-1 FW,仅为‘亚德’的10.2%。AsA-GSH循环再生代谢中,脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性在果实膨大期达到最高,成熟期降至最低,其中‘布劳德’果实中DHAR和MDHAR活性略高于‘亚德’和‘黑丰’;谷胱甘肽还原酶（GR）活性在幼果期最高,‘亚德’幼果期果实中GR活性最高（0.06 μmol·min ^-1·g ^-1 FW）,之后随着果实的生长发育不断下降,抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性变化与之相似;L-半乳糖途径的关键酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）活性随着果实生长发育的变化趋势与AsA含量变化相一致,且‘亚德’果实中GalLDH活性在幼果期和成熟期均高于其他两个品种。通过相关性分析发现,GalLDH与T-AsA、AsA、DHA、DHAR和MDHAR呈现极显著正相关关系,相关系数可达0.91以上,即果实中GalLDH活性越高,果实中AsA含量也越高;DHAR和MDHAR与T-AsA、AsA间也存在极显著正相关关系,而APX与T-GSH、GSH间相关性较强。【结论】 黑穗醋栗幼果期果实中AsA含量最高,且品种间差异显著;GalLDH、MDHAR和DHAR可能是黑穗醋栗果实中AsA合成代谢的关键酶,黑穗醋栗果实中AsA含量积累主要取决于GalLDH活性,说明合成途径起着更关键的作用,而AsA-GSH循环再生途径相关酶对AsA合成也有一定的贡献,黑穗醋栗高AsA含量的积累是由合成途径与循环途径共同作用的结果。     

24-表油菜素内酯对低温胁迫下葡萄幼苗抗氧化系统 及渗透调节物质的影响

【目的】探讨外源EBR（24-表油菜素内酯）对低温胁迫下葡萄幼苗抗氧化系统及渗透调节物质的影响。【方法】以欧亚种（Vitis vinifera L.）鲜食葡萄品种‘紫脆无核’营养袋扦插苗为试材,分别在4℃和0℃低温条件下,研究外源EBR对葡萄幼苗4种抗氧化酶活性（CAT、SOD、POD及APX）、超氧阴离子（ ）和丙二醛（MDA）含量以及渗透调节物质游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响。【结果】在两种低温胁迫条件下,外源EBR处理均使葡萄叶片抗氧化酶CAT、POD、SOD及APX活性升高,且总体与对照之间差异显著;同时也使葡萄叶片抗氧化物质GSH及AsA含量升高,在4℃和0℃条件下,GSH平均含量较对照分别升高5.4%及7.8%,AsA含量分别升高8.8%及13.0%;EBR处理使叶片 及MDA含量降低, 平均较对照分别降低28.5%及17.3%,MDA含量分别降低6.8%及7.5%;EBR处理明显提高了葡萄幼苗叶片脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量,平均含量较对照分别提高8.4%和59.1%、3.5%和5.2%及18.6%和25.0%。【结论】在低温胁迫下,外源EBR通过提高抗氧化酶活性、抗氧化物质含量及渗透调节物质含量,减少了活性氧(ROS)的积累及膜脂过氧化产物MDA的产生,增强了葡萄幼苗耐低温胁迫的能力。     

水稻木葡聚糖内糖基转移酶基因OsXTH11过表达的作用分析

【目的】利用转基因技术对水稻XTH（OsXTH11）进行分析,了解其在水稻生长发育调节和逆境应答中的作用。【方法】构建OsXTH11过表达载体,利用农杆菌介导法将其导入水稻品种日本晴,通过对转基因植株进行表型分析和分子检测验证OsXTH11功能。【结果】Real-time PCR分析结果表明,转基因植株中OsXTH11表达水平明显提高。对T1转基因幼苗的表型分析显示,在正常生长条件下,转基因幼苗生长速度快于野生型;对赤霉素（GA）和生长素（IAA）的响应程度强于野生型;在黑暗和深水条件下,茎伸长速度均显著快于野生型;对100 mmol•L-1 NaCl的耐受能力也优于野生型植株。【结论】过量表达水稻木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因OsXTH11的转基因植株表型显示,OsXTH11在水稻生长发育和抗盐胁迫中发挥作用。     

过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究

 【目的】利用转基因技术研究转录因子OsbZIP60的生物学功能,为培育抗逆水稻、减轻高温干旱对水稻的伤害奠定基础。【方法】构建水稻OsbZIP60的过表达载体pHB-OsbZIP60,通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入水稻品种日本晴,通过观察转基因植株和野生型植株在胁迫条件下的表型差异,分析其生物学功能。采用半定量PCR和荧光定量PCR检测OsbZIP60的表达模式以及其在转基因植株中的表达水平。【结果】在转基因植株中,OsbZIP60表达量明显高于野生型日本晴植株。OsbZIP60的表达受热信号诱导,在热激条件下,转基因植株的OsbZIP60表达量进一步升高。OsbZIP60在水稻各组织中均有表达,且在成熟植株叶片中表达量最高。转基因植株与野生型相比具有更强的抗胁迫能力,并且离体部分失水率更低。【结论】水稻转录因子OsbZIP60在水稻热胁迫和干旱胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsbZIP60能够增强水稻的抗热和抗旱能力。