利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以Pita、Pi21和ERF922为靶基因,构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-g~(Pita)-g~(Pi21)-g~(ERF922),用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T_0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T_1代能够稳定遗传给T_2代,并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

甘蓝型油菜和甘蓝CRISPR/Cas9编辑效果的快速检测

CRISPR/Cas9系统是目前最常用的基因组定点编辑工具，通过瞬时表达试验提前验证Cas9/sgRNA载体诱导的突变效率，可以提高基因组定点编辑成功的几率，且显著节省费用及时间。本研究开发了一种利用农杆菌介导的操作简单、适用性好、成本低廉的叶片瞬时表达技术，可用于快速检测甘蓝型油菜和甘蓝中CRISPR/Cas9的编辑效果。针对甘蓝型油菜BnaC.WRKY11.a设计了2个靶位点Tgt1（Target 1）和Tgt2（Target 2），并构建了Cas9/sgRNA-Tgt1/2多重突变载体，在甘蓝型油菜叶片中瞬时表达后，2个靶位点都出现突变，突变效率达11.2%～82.2%。针对甘蓝BolPDS3基因设计了1个靶位点Tgt3（Target3），并构建了Cas9/sgRNA-Tgt3敲除载体，在甘蓝叶片瞬时表达后，Tgt3发生了突变，且大部分为碱基缺失突变，缺失的数目为1～18bp不等，同时还存在少量碱基插入以及碱基替换等突变类型。结果表明这种甘蓝型油菜和甘蓝的叶片瞬时表达技术操作简单、适用性好、成本低廉，CRISPR/Cas9的编辑效果快速易检测。     

CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因

【目的】 直链淀粉含量与稻米品质密切相关。Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因,通过对Wx基因定点编辑以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。【方法】 构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA (靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子),利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27,潮霉素筛选获得转化株系,对转化株系及其后代进行分子检测、测序、基因表达和遗传稳定性分析以及直链淀粉含量测定。【结果】 获得9个独立的T₀代转化株系,靶点1(L1~L5) 5个株系,突变频率100%,靶点2(L6~L9) 4个株系,突变频率75%。由T₀代突变体衍生出T₁和T₂代株系,测序发现T₀、T₁和T₂代株系出现缺失(单、双、多碱基缺失)和单碱基插入两种突变类型;T₀至T₁代部分株系(L1、L2、L3和L6)发生再编辑,T₁至T₂代遗传稳定。与野生型相比,突变株系RNA水平Wx基因表达量显著下降(P<0.01),稻米直链淀粉含量显著降低(P<0.01),从17.5%降到1.93%。【结论】 利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx基因,获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的突变体,为稻米品质改良提供了材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系，为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点，构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21，转化优质常规籼稻品种中早70，测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定，利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中，Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%，突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系，获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明，与野生型相比，T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调，ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性，TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低，高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比，在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调，并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑，获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系，为高抗、香型不育系材料的选育提供参考，加快高产优质杂交水稻的选育。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

[目的]为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料.[方法]以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定.[结果]AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67％和75.00％.所有突变株系中,突变类型仅有插入...     

水稻稻瘟病抗性基因Pi ta的SNP检测方法

 针对稻瘟病抗性基因Pi ta位点上的抗感基因的编码产物仅有1个氨基酸的差异,利用已经建立的检测该基因的SNP方法以及作者在该基因编码序列构建的四引物扩增受阻突变体系PCR,对62份2012年长江上游国家水稻区域试验材料和97份陕西省水稻区域试验材料进行了Pi ta基因检测,2种分子标记检测结果一致。该方法的检测结果真实可靠,可以用于检测水稻Pi ta基因位点。     

利用CRISPR/Cas9技术创制Rc基因恢复红稻

【目的】将栽培稻品种恢复为米质优、抗逆性强的红稻具有较大的研究价值。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,编辑原花青素转录调节因子Rc基因,恢复红种皮特性,以改良水稻米质,提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以Rc为靶基因,构建突变载体p YLCRISPR/Cas9-Rc-g RNA,以空育180、上育453为材料,转化获得转基因植株,通过测序手段和表型观察验证成果。【结果】分子水平检测获得Rc突变材料2种,其中KY-1在1414―1417bp缺失4个碱基,终止子突变为苯丙氨酸;SY-1在1411bp处缺失1个碱基,终止子突变为天冬氨酸。2种编辑材料均恢复为红米表型,且具有一定耐盐碱能力。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得恢复红种皮表型的纯合株系,为红米改良提供基础材料。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

利用dsRNA干涉方法研究水稻WRKY转录因子的抗病性

 为了研究植物WRKY基因编码的转录因子在水稻上的功能，构建了包含WRKY保守结构域的dsRNA发夹结构干涉载体，用农杆菌介导法转野生型水稻中花11，得到9个有干涉表型的株系。PCR和Southern结果表明dsRNA已整合入中花11的基因组中，且多数为单拷贝。结合T-DNA插入的WRKY突变体植株T456，研究了其中的3个干涉苗和T456对稻瘟病和白叶枯病的抗性，发现3个干涉苗对这两种水稻主要病害的抗性均明显强于T456和中花11，且T456比中花11略抗稻瘟病和白叶枯病，表明dsRNA干涉是成功的，它可能干涉或抑制了某些OsWRKY家族中负向调控抗病基因的成员。     

分子标记辅助选择改良三系杂交稻恢复系R225稻瘟病抗性

稻瘟病是水稻的主要病害,培育抗稻瘟病品种是防治稻瘟病的有效途径。本研究通过分子标记辅助选择与杂交育种相结合的方式,将稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2和Pi9导入到三系杂交稻恢复系R225。对BC3F3代材料进行苗期和成熟期稻瘟病抗性鉴定,携带1个或2个抗性基因的目标株系抗性达到中抗以上水平,稻瘟病抗性显著高于各自的轮回亲本。SSR标记分析表明,改良株系的遗传背景回复率达到86.1%~95.3%。通过标记辅助选择获得的改良材料为三系杂交稻恢复系的培育提供了稻瘟病抗性亲本。     

Comparative analysis of the proteomic and nutritional composition of transgenic rice seeds with Cry1ab/ac genes and their non-transgenic counterparts

Nutritional assessment of transgenic crops used for human food and animal feed is an important component of safety evaluations. Profiling techniques, such as proteomics, are currently used as complementary analytical tools to detect the unintended effects of transgenic. We analyzed the proteomic profiles and nutritional composition of transgenic rice seeds containing the Cry1Ab/Ac protein to assess the safety of these transgenic seeds. We focused primarily on the effects of genetic modification and growth environment. By comparing proteomic profiles, we found that 21 proteins were up- or down-regulated as a consequence of environmental influence (WT01 vs. WT02). Similarly, 20 to 22 protein levels were differentially modulated in transgenic rice seeds in comparison to their non-transgenic counterparts (T01 vs. WT01; T02 vs. WT02). These latter changes may be due to the influence of growth environment and the insertion of a single gene into the rice genome. Based on the nutrient composition analysis (proximates, amino acids, fatty acids, minerals, vitamins and anti-nutritive components), we conclude that the nutritional quality of the rice from the transgenic lines was equivalent to that of its non-transgenic counterparts and that the effect of growth environment on the rice was no less than that of the single gene insertion.     

一个水稻类病变黄叶突变体的鉴定和精细定位

从15000多个水稻转基因株系中发现了一个类病变黄叶突变体.该突变体最显著的特征为叶片由下而上依次黄化,同时出现类似病原体感染的病斑.根据突变体表型,将该突变体命名为syll(spotted and yellow leayes 1).遗传学分析表明,该突变性状受1对隐性核基因控制.PCR检测和潮霉索抗性分析显示.该突变...