簇毛麦3V染色体短臂特异分子标记的开发与应用

普通小麦野生近缘物种簇毛麦(Haynaldia villosa L. 2n=14, VV) 3V染色体短臂（3VS）携带抗小麦条锈病基因。开发高密度的3VS特异标记是准确鉴定和追踪3VS、推进抗病基因转移和利用的重要基础。为了开发更多的均匀分布于3VS染色体臂不同区段的分子标记，本研究利用簇毛麦和小麦品种中国春参考基因组序列与基因注释信息，通过比较3VS与3AS、3BS、3DS同源基因序列内含子序列差异，选择同一内含子长度差异大于10%的区域开发了104个跨越内含子(intron targeting, IT)的分子标记，在簇毛麦、簇毛麦-硬粒小麦双二倍体、硬粒小麦中引1286、中国春、普通小麦-簇毛麦二体异附加系DA1V-DA7V、小麦-簇毛麦T3VS·3DL易位系中进行扩增，筛选出3VS特异、扩增条带清晰且稳定性好的IT分子标记43个。为了验证上述标记的有效性，选择位于3VS不同区段的12个标记对［DS3V(3D)×中国春ph1b］的F₃群体中的148个ph1b纯合的单株进行分析，共筛选得到6种类型涉及3VS的结构变异体。进一步利用GISH/FISH技术对上述材料进行鉴定，结果与分子标记结果相吻合，证明利用外源染色体特异分子标记可有效筛选涉及外源染色体结构变异体。     

InDel分子标记WC656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5VS纯合易位中的应用

簇毛麦是小麦品种改良重要的遗传资源,其5VS上含有硬度基因Dina/Dinb、抗白粉病基因Pm55和抗条锈病基因Yr5V,创制普通小麦-簇毛麦5VS易位系新种质,对于高效利用5VS上的有益基因进行小麦品种遗传改良具有重要意义。为了便于鉴别普通小麦-簇毛麦5VS纯合易位,本研究以mInDel软件分析普通小麦中国春基因组序列,开发了小麦第5同源群短臂的InDel特异分子标记WC656,对小麦品种以及普通小麦-簇毛麦5VS.5AL和5VS.5DL易位系及其衍生后代进行PCR扩增,根据扩增片段大小来区分5AS、5BS、5DS染色体臂以及5VS易位系。结果表明,在21个普通小麦品种、小麦-簇毛麦5VS回交F₂代中杂合易位单株,均扩增出379 bp（5AS）、471 bp（5BS）、422 bp（5DS）3条带。在T5VS.5AL高代品系、回交F₂代中纯合易位单株扩增出471 bp（5BS）、422 bp（5DS）2条带,379 bp（5AS）条带缺失。T5VS.5DL高代品系、回交F₂代中纯合易位单株扩增出379 bp（5AS）、471 bp（5BS）2条带,422 bp（5DS）条带缺失。WC656鉴别的5VS纯合易位结果与顺序FISH-GISH分析结果一致。T5VS.5AL、T5VS.5DL具有抗白粉病、籽粒硬度指数低等优良特性。因此,利用InDel分子标记WC656可以鉴别普通小麦-簇毛麦T5VS.5AL、T5VS.5DL衍生后代中的纯合易位,PCR扩增实验操作相对简便,可以为分子标记辅助选育携有5VS纯合易位的软质弱筋小麦提供帮助。     

簇毛麦基因组特异DNA序列标记的建立和应用

为建立簇毛麦基因组特异DNA序列的分子标记，以普通小麦中国春、绵阳11、川农17和R111以及多年生簇毛麦、硬粒小麦一多年生簇毛麦双二倍体TDB-3为材料，用120条随机引物进行RAPD分析，筛选出一个多年生簇毛麦的特异性RAPD片段。克隆测序表明该片段全长为937bp（记为OPM2 937）。以OPM2 937的DNA序列为基础设计了一对特异引物，并用该特异引物对多年生簇毛麦、二倍体簇毛麦以及中国春-二倍体簇毛麦附加系CSDA1V～CSDA7V与小麦-多年生簇毛麦衍生后代进行了扩增，结果表明，凡具有簇毛麦染色体的材料均可扩增出目标DNA片段，而不具簇毛麦染色体的材料均未能得到扩增。将OPM29 937在NCBI中进行序列比对，发现它是一个新的序列，说明OPM2 937为簇毛麦基因组的一个特异序列，该DNA序列标记可用于快速跟踪检测小麦背景中的簇毛麦染色体。     

普通小麦-簇毛麦1V染色体系的选育与鉴定

为了转移和利用簇毛麦1V染色体上的优质基因,用中国春和硬粒小麦-簇毛麦双倍体杂交,再用中国春回交,综合运用染色体C-分带、荧光原位杂交、高分子量谷蛋白亚基分析和分子标记分析,从BC1F1~BC1F3代中检测到1V染色体系,在BC1F3、BC2F1代中选育出分别涉及簇毛麦1V染色体长臂和短臂的四种染色体结构变异系,包括1VS.W易位系、W.1VL易位系、1VS单端体系和1VL端二体系,为小麦育种创造了新的种质资源。     

族毛麦基因组及其在小麦改良中的应用研究进展

簇毛麦是小麦的近缘属，是小麦改良重要的基因资源。簇毛麦有益基因向小麦遗传背景的导入，主要利用小麦－簇毛麦双二倍体为桥梁亲本，通过杂交、回交等方式获得小麦异代换系、异附加系、异易位系；并且利用形态标记、细胞学标记、生化标记及分子标记对小麦遗传背景下的染色体组、染色体、染色体臂及片段进行鉴定。本文对这些方面的研究进展进行了综述，对族毛麦可利用基因进行了展望。     

粗穗披碱草1HtS染色体的蛋白质二硫键异构酶基因CAPS标记

中国春-粗穗披碱草罗伯逊1Ht S.1BL易位系高抗小麦条锈病、叶锈病和白粉病。为了获得抗病小片段易位系,用中国春ph1b基因缺失突变体对1Ht S.1BL进行了诱导,获得了大量诱导后代。本研究用位于小麦1DS染色体的87个EST-STS标记对中国春、粗穗披碱草和1Ht S.1BL易位系进行分析,未发现多态性标记。对其中扩增较好的引物BE444859的PCR产物进行随机克隆测序,获得了14个序列,与已发表的小麦蛋白质二硫键异构酶基因序列具有97%以上的同源性,14个序列均包含3个外显子和2个内含子。限制性酶切位点分析表明,仅2个序列含有HaeIII酶切位点。验证实验结果表明,BE444859/HaeIII组合可以在供试材料中获得多态性。进而用BE444859/HaeIII对一套中国春-粗穗披碱草附加系和151株诱导后代材料进行分析,结果显示,特异多态性条带仅出现在含1Ht S的材料中;68株后代材料均可扩增出多态性带。因此,BE444859/HaeIII可以作为粗穗披碱草蛋白质二硫键异构酶基因CAPS标记,用于检测小麦背景中的1Ht S染色体。本研究揭示当杂交亲本间无直接PCR多态性而又需要建立标记时,发展CAPS标记是行之有效的方法。     

小麦 簇毛麦T4DL·4VS易位染色体在不同背景中的遗传稳定性及其在配子中的传递

为了给小麦-簇毛麦T4DL·4VS易位系在小麦育种中的利用提供依据,用T4DL·4VS易位系与来源于不同生态区的5个小麦品种郑麦9023、周9823、绵阳26、石4185、扬麦15进行杂交,杂种F1再分别与上述品种进行正反回交,研究小麦-簇毛麦T4DL·4VS易位染色体在不同小麦背景中的遗传稳定性及其在配子中的传递.原位杂交结果表明,在杂种F1花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ,T4DL·4VS易位染色体通常可以与4D染色体配对形成棒状二价体.在不同组合的F2分离群体中,T4DL·4VS易位染色体在不同小麦遗传背景中的遗传方式不相同,T4DL· 4VS易位染色体的传递受到小麦遗传背景的影响.测交结果表明,T4DL·4VS易位染色体通过雌配子和雄配子的传递率分别为50.59％(46.15％～59.1％)和24.02％(16.67％～37.75％),T4DL·4VS易位染色体通过雌配子的传递率显著高于通过雄配子的传递率.     

簇毛麦6V染色体短臂特异性EST标记的开发及缺失定位

为了准确鉴定簇毛麦6VS易位染色体小片段的长度和断点位置,根据定位于小麦第6部分同源群染色体短臂不同区段的EST序列,利用PRIMER5.0软件设计PCR引物,成功开发出3个对6V染色体短臂特异的分子标记(CINAU89-740、CINAU90-730、CINAU91-390)。利用小麦和簇毛麦第六部分同源群染色体短臂的12个缺失系对簇毛麦6VS的8个特异性分子标记进行了定位。标记CINAU88-381、CINAU17-1086、CINAU15-902分别被定位在FL值为0.79~0.99、0.58~1.00、0.46~0.58的染色体区段,标记CI-NAU91-390、CINAU90-730、CINAU16-1650被定位在FL值为0.35~0.45的染色体区段,标记CINAU18-723、CINAU89-740被定位在FL值为0.00~0.45的染色体区段。利用这8个分子标记可以更准确地鉴定6VS小片段易位的断点和片段长度。     

小麦 黑麦大粒1BL/1RS易位系的分子细胞学鉴定

为明确小麦 黑麦大粒衍生系14 1 2的遗传组成,综合采用细胞学、基因组原位杂交(GISH)、SCAR标记、SSR标记对该衍生系进行鉴定。黑麦基因组特异SCAR标记鉴定表明,14 1 2含有黑麦遗传物质;有丝分裂和减数分裂中期Ⅰ染色体数目为2n= 42=21Ⅱ。以黑麦基因组为探针的GISH检测表明,14 1 2含有2个黑麦染色体臂。黑麦7条染色体上的特异标记鉴定表明,只有黑麦1RS上的特异SCAR标记在14 1 2中扩增出黑麦特异条带。小麦7个部分同源群染色体长短臂上的SSR引物鉴定表明,只有1BS上的4对引物在14 1 2中未扩增出1BS的条带,其余染色体上的引物均扩增出了相应条带。由此证实小麦1BS被黑麦1RS所替代,衍生系14 1 2为1BL/1RS易位系材料。     

小麦-滨麦衍生系18DM134的分子细胞遗传学及赤霉病抗性鉴定

滨麦[Leymus mollis(Trin.) Pilger]作为小麦的野生亲缘种之一,具有抗寒、抗旱、耐盐碱等优良特性,同时对多种小麦病害具有良好抗性,是小麦遗传改良的重要基因资源。本研究前期从八倍体小滨麦M842和硬粒小麦D4286的杂交后代中筛选出一个抗赤霉病的衍生系18DM134,为给该材料的利用提供依据,本研究利用细胞遗传学、原位杂交、液相芯片、分子标记等技术对其染色体组成进行鉴定,并对其农艺性状和赤霉病抗性进行调查。细胞学观察结果显示,18DM134的染色体构型为2n=42=21Ⅱ。原位杂交结果显示,18DM134含有38条小麦染色体、2条完整的Ns染色体以及2条易位染色体,其中整条6A染色体和5DS染色体缺失,2条Ns染色体片段易位到3DS染色体,2条3DL染色体易位到5DL染色体。液相芯片和分子标记分析结果显示,18DM134中来自滨麦的6Ns染色体替换了小麦6A染色体,部分5Ns染色体片段与3DS染色体发生了易位,5DS染色体缺失。因此,18DM134为小麦-滨麦代换易位系,其染色体组成为12A+14B+10D+2(6Ns)+2(T3DS-5Ns片段)+2(T3DL-...     

小麦条锈病新抗源92R149的初步利用与评价

抗条锈病小麦新种质92R149系南京农业大学细胞遗传研究所利用簇毛麦创造的普通小麦6VS/6AL易位系。经绵阳市农科所5年的观察和利用研究,发现它具有对条锈病和白粉病高抗～免疫、抗性遗传力强、配合力好、综合农艺性状较好等突出特点,是四川省小麦抗病育种可资利用的难得的优良抗条锈病和白粉病新抗源。但其植株偏高,分蘖力强,有效穗数偏少,籽粒偏小且为红粒,在利用中应注意予以改善。     

Molecular characterization of the Puroindoline a-D1b allele and development of an STS marker in wheat (Triticum aestivum L.)

Kernel hardness is mainly controlled by one major genetic locus on the short arm of chromosome 5D in bread wheat. Twelve Chinese and CIMMYT wheat cultivars were characterized for the deletion region of Pina-D1b genotype and developing a novel STS marker for this allele. PCR and SDS-PAGE were used to confirm the Pina-D1b genotype, and then 20 pairs of primers were designed to amplify the fragment including deletion region in Pina-D1b genotype by primer walking strategy. An STS marker Pina-N spanning deletion region in Pina-D1b was developed and sequencing results showed that all of 10 Pina-D1b genotypes uniformly possessed a 15,380 bp deletion in comparison with that of Chinese Spring with wild type. This study provided an alternative method to exam Pina-D1b by molecular marker and will accelerate identification of puroindoline alleles in bread wheat.     

异源细胞质小麦的抗旱性研究

以分别具有山羊草属、小麦属和簇毛麦属的15种普通小麦近缘种细胞质的异源细胞质小麦为材料．采用高渗溶液法、水培盆栽法和田间鉴定法研究了异源细胞质对小麦抗旱性的遗传效应。结果表明，波斯小麦（T.persicum）、柱穗山羊草（Ae．cylindrica）、簇毛麦（Hanaldia villosa）和粗厚山羊草（Ae．crassu 6x）细胞质对小麦的抗旱性具有明显的遗传效应。其效应值的性质、大小与核亲毒品种的基因型有关，在特定的核质组合中波斯小麦、柱穗山羊草、簇毛麦和粗厚山羊草细胞质可明显提高小麦的抗旱性。具波斯小麦细胞质的异质系（T．persicum）-s．c66种子发芽阶段和三叶期的抗旱性比相应核亲本明显增强．并且超过抗旱品种晋麦47。成熟期的鉴定结果表明．经核基因型改良的粗厚山羊草细胞质小麦新品系NC223、NC232和NC236等15个异质系具有较强的抗旱性。因此，进一步研究异源细胞质提高小麦抗旱性的遗传机制，有助于拓宽小麦抗旱育种途径。     

华山新麦草3Ns染色体特异SCAR标记的开发

为快速准确地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,采用150条10bp的随机引物R1-R150对华山新麦草、普通小麦7182、中国春及华山新麦草1Ns-7Ns全套二体附加系共10个材料进行了RAPD分析,从中获得了华山新麦草3Ns染色体上2个特异RAPD分子标记片段FR-113和FR-125。克隆这两个片段并测序,发现其全长分别为543bp和515bp;分析序列后对其分别设计SCAR引物S-113和S-125,重新对10个材料进行SCAR分析,结果只在华山新麦草和小麦-华山新麦草3Ns二体附加系上扩增出了特异条带,由此证明已将华山新麦草3Ns染色体上获得的两个RAPD标记成功转化为稳定可靠的SCAR标记。这两个SCAR标记可用于检测小麦背景下的华山新麦草3Ns染色体,同时为小麦-华山新麦草杂交后代提供了分子鉴定依据。     

小麦-华山新麦草7Ns异附加系的分子细胞遗传学研究

为了给有效利用华山新麦草基因提供新的种质材料,利用细胞遗传学、分子标记等技术,结合田间农艺性状考察,对从小麦-华山新麦草七倍体材料H8911-99与硬粒小麦D4286杂交F4代分离群体中选育的杂交后代12DH25进行了鉴定。华山新麦草基因组特异SCAR标记鉴定表明,12DH25含有华山新麦草遗传物质;有丝分裂和花粉母细胞减数分裂中期I染色体数为2n=44=22Ⅱ,基因组原位杂交(GISH)出现两条杂交信号,且能配对,表明两条外源染色体是华山新麦草的一对同源染色体。选取定位于小麦7个部分同源群上的28对STS标记对12DH25及其亲本基因组DNA进行扩增,定位于小麦第7同源群上的STS标记BE591127和BG274576能在12DH25中扩增出华山新麦草特征条带,将12DH25附加的华山新麦草染色体归属于小麦第7部分同源群。由此确定矮秆材料12DH25是一个稳定的小麦-华山新麦草7Ns二体异附加系。     

春小麦育种材料抗旱性和穗发芽抗性分子标记鉴定

为给春小麦生育早期抗旱和收获期抗穗发芽育种提供抗性亲本,利用与小麦抗旱性相关的分子标记TaNRX-B1a1、TaNRX-B1b1和FerA1-intrl以及与小麦穗发芽抗性相关的分子标记Vp1B3、Vp1A3和Tamyb10D对137份内蒙古春小麦育种材料进行检测。结果表明,73B609等共58份材料的抗旱性分子标记均属于抗旱基因型,占供试材料的42.34%,其单倍型组合为TaNRX-B1a/TaFer-A1a,可以用作抗旱育种的亲本材料。中国春既属于Vp-1Bb等位基因类型,同时用标记Tamyb10D检测时也属于抗穗发芽类型。辽春10号在3个分子标记的检测中均属于抗穗发芽的等位基因类型,同时又是TaNRX-B1a/TaFer-A1a单倍型,所以辽春10号在抗穗发芽和抗旱性聚合育种中可以作为亲本使用。     

受白粉菌诱导表达的簇毛麦草酸氧化酶基因(Hv-OxOLP)的克隆和分析

为了筛选抗白粉病基因Pm21介导的抗病途径中的防卫基因，采用芯片杂交技术筛选携带或不携带Pm21基因的材料之间或抗病材料经白粉菌诱导与非诱导样品之间的差异表达基因，并采用RT-PCR方法分析了被筛选出的草酸盐氧化酶类似蛋白基因（Oxalate Oxidase Like Protein，OxOLP）的表达情况，进一步利用TAIL-PCR方法分离簇毛麦基因Hv-OxOLP中的全长序列。芯片杂交结果表明，探针Contig3156（一个推导的草酸盐氧化酶类似蛋白基因）在抗病簇毛麦中受白粉菌诱导的程度最大，在抗病易位系中该探针的杂交信号比在感病扬麦5号中的杂交信号强。半定量RT-PCR结果表明，在抗、感白粉病的材料中草酸盐氧化酶类似蛋白基因都受白粉菌诱导表达，但在抗病材料中达到表达峰值的时间早。用TAIL-PCR方法分离的Hv-OxOLP有一个内含子和两个外显子，ORF包含690个核苷酸，在启动子区包含两个W-box，在终止密码子后面还有一个polyA的加尾信号。作为一个受白粉菌诱导表达的基因，HpOxOLP在抗白粉病反应中可能起重要的作用。     

甘肃省新育成小麦品种(系)面粉色度相关基因分子检测

为了鉴定甘肃省新育成小麦品种（系）面粉色泽相关基因的分布情况,利用STS标记鉴定了103份新育成小麦品种（系）的1BL/1RS易位系及与黄色素含量和多酚氧化酶活性相关的等位变异类型。结果发现,供试材料中,有37份材料为1BL/1RS易位系,占35.92%;42份为非1BL/1RS易位系,占40.78%;其余均为片段易位或其他易位系。在黄色素含量分子检测中, Psy-A1位点有3个等位变异, Psy-A1a所占比例最大,频率达91.26%, Psy-A1b 和 Psy-A1c 分别占7.77%和0.97%; Psy-B1 位点的3个等位变异中, Psy-B1a 、 Psy-B1b 和 Psy-B1c 频率分别为62.13%、28.16%和18.45%; Psy-D1 位点有 Psy-D1a 和 Psy-D1g 两个等位变异,其中 Psy-D1a 分布频率为97.09%。在PPO活性等位基因中,与低PPO活性相关的基因 Ppo-A1b 和 Ppo-B1a 分别占34.95%、77.67%;与高PPO活性相关的基因 Ppo-A1a 、 PPO-B1b 、 PPO-D1b 分别占54.36%、 19.46%、40.77%。黄色素含量和PPO活性相关的基因组成以中间类型居多。甘肃省新育成小麦品种（系）中,1BL/1RS易位系材料频率有所下降,黄色素含量及PPO活性相关等位基因均有一定分布,在未来小麦育种工作中仍需加强面粉色泽的选择。