橡胶树多主棒孢病菌Cassiicolin基因条形码数据库构建及分子检测技术

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是为害我国主要热带作物的植物病原真菌,其寄主范围广、形态差异显著、症状类型多样,且含有一种寄主专化性毒素Cassiicolin,存在6种毒素类型。本研究利用已公布的Cassiicolin毒素基因（Cas1~Cas6型）,构建了含287个菌株的国内橡胶树和部分热带作物多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库,建立了一套特异性强、灵敏度高的分子检测技术,可检测100 pg/μL的目标基因组DNA,系统分析了我国橡胶树、木薯、番木瓜、瓜菜等主要热带作物的919株多主棒孢的毒素类型,发现国内仅存在Cas2和Cas5这2种毒素类型,其中Cas5型的菌株占94.8%,为橡胶树多主棒孢的优势种群和特有毒素类型。而Cas2型是橡胶树和其他作物多主棒孢共有的毒素型。系统发育分析发现,不同毒素类型的多主棒孢菌株与寄主来源密切相关,但与地理来源没有明显的相关性,且Cas5型多主棒孢具有明显的寄主专化性。通过构建多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库,为明确我国主要热带作物多主棒孢病菌的种群结构和优势种群情况,发掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要的指导意义。     

我国热带作物多主棒孢种群多样性及致病力分化分析

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一种全球分布的重要植物病原真菌,寄主范围十分广泛。近年来,该病原菌侵染危害多种热带作物,并在局部地区大面积暴发流行,造成巨大的经济损失。本研究利用核糖体转录间隔区（Internal transcribed spacer, ITS）、翻译延伸因子（translation elongation factor 1 alpha, EF-1α）、β微管蛋白（β-Tubulin, TUB）,对来自橡胶树、木薯、番木瓜和瓜菜等多种热带作物的70株多主棒孢进行种群多样性分析。结果发现,利用最大似然法,在相似系数为0.97时可将供试菌株划分为两大遗传类群：类群Ⅰ为国内和一些国外橡胶树的多主棒孢;类群Ⅱ为其他寄主多主棒孢,遗传类群与寄主来源具有显著的相关性。致病力测定表明,多主棒孢种内致病力分化明显,类群Ⅰ的橡胶树多主棒孢仅能侵染橡胶树,不能侵染其他寄主,具有明显的寄主专化性,且不同地理来源的菌株致病力差异不显著。类群Ⅱ的多主棒孢在不同寄主间可以相互侵染,但菌株在致病力和发病症状上存在一定差异,表现出对其原寄主的高度致病力。多基因序列聚类分析与致病力分化分析结果具有较好的一致性,这为研究我国热带作物多主棒孢的种群结构、主要致病型以及为多主棒孢病害的发生、流行和防治提供了理论依据。     

间作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落结构的影响

研究间作木薯对橡胶树根际土壤真菌群落多样性变化规律,为判断胶园间作木薯的可行性提供理论支撑。以橡胶与木薯间作为处理,橡胶单作为对照,采用传统方法和高通量测序技术分析橡胶树根际土壤理化性状及真菌群落结构。结果表明：（1）间作模式下橡胶树根际土壤的碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量和真菌Shannon指数显著降低,真菌Simpson指数显著提高,pH和Chao1指数虽有降低,但差异未达到显著水平;（2）门分类水平上,2个处理的橡胶树根际土壤真菌群落结构组成相近,共有的3大优势菌门均为Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota。间作木薯降低了橡胶树根际土壤中Zygomycota和Basidiomycota的相对丰度,但提高了Ascomycota相对丰度,达到91.54%;（3）属分类水平上,2个处理中相对丰度比例前10的优势菌属占所有检测出菌属的61.30%~65.59%,间作木薯提高了橡胶根际土壤中Phyllosticta、Gibberella和Lecythophora的相对丰度;（4）土壤碱解N、速效P和速效K含量对橡胶树根际土壤中真菌群落α-多样性产生影响,土壤真菌多样性变化与土壤有机质含量有关。因此,间作木薯增加了植物对土壤矿质营养元素的吸收,导致橡胶树根际土壤肥力下降,进一步降低了橡胶树根际土壤真菌的群落多样性,同时增加了病原真菌的丰度。     

内生真菌HND5挥发性物质组分分析及其抑菌作用测定

HND5是从健康的臂形草叶片中分离得到的一株顶孢霉属(Acremonium sp.)内生真菌,可通过产生挥发性物质抑制病原菌生长。采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)提取富集了内生真菌HND5的挥发性有机物(VOCs),利用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)进行了挥发性物质的组分分析,共分离鉴定得到14个单体化合物。活性分析发现,石竹烯(Caryophyllene)和4-乙烯基-1,2-二甲氧基苯(Benzene,4-ethenyl-1,2-dimethoxy-)具有抑菌活性,对峙试验表明2种物质均对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)具良好的抑制作用,其中石竹烯的有效中浓度(EC50)分别为2 916.07、729.54和404.23μL/L,4-乙烯基-1,2二甲氧基苯的有效中浓度(EC50)分别为62.72、27.60和23.54μL/L。     

海南广藿香内生真菌分离鉴定及拮抗菌株筛选

本研究从海南广藿香的根、茎、叶和花等组织中分离获得61株内生真菌,采用显微形态观察和ITS序列分析鉴定为15个属,其中优势菌群为炭疽菌属（Colletotrichum）和干酪酵母菌属（Meyerozyma）。以澳洲坚果叶枯病菌（Pestalotiopsis microspora）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和火龙果溃疡病菌（Neoscytalidium dimidiatum）为指示菌,采用平板对峙法进行拮抗菌株筛选,发现镰刀菌属（Fusarium）菌株PfuJ20、PfuG16和PfuG5对澳洲坚果叶枯病菌的抑制效果最好,棒孢属（Corynespora）菌株PfuH2对西瓜枯萎病菌抑菌效果较好。采用滤纸片扩散法进行各菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等动植物病原细菌的抑菌作用评价,发现镰刀菌属PfuJ20、PfuG16对各细菌均有较强抑制效果,而链格孢属（Alternaria） PfuH1对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果相对最强。结果表明,海南广藿香内生真菌具有一定的生物多样性,部分内生真菌菌株具有较强的抑菌活性。     

海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

白蚁（Isoptera）的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源,以海南白蚁共生放线菌为研究对象,利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌,利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7,系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属（Streptomyces）亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强,平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性,抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广,对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性,其中对芒果胶孢霉（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、香蕉炭疽霉（Colletotrichum musae）、辣椒棒孢霉（Corynespora cassiicola）、豇豆瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp]抑制作用较强,对芦笋拟茎点霉（Phomopsis asparagi）、荔枝疫霉（Peronophythora litchi）抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性,但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定,并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株,为高效生防菌剂的研发提供新资源。     

大豆根腐病菌拮抗细菌筛选及抗生作用

从大豆根际土壤中分离纯化得到388个细菌菌株,从中筛选对大豆根腐病病原尖孢镰刀菌(Fusaritm oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有拮抗作用的菌株,采用无菌室内点接法初筛,抑菌带大于20mm以上的有12株,通过盆栽防效试验,进一步证明12个菌株中有6个菌株盆栽防治尖孢镰刀菌和立枯丝核菌达到46.0%-78.5%.菌株与病原真菌共培养结果显示,菌株B2、B57、B85和B69使尖孢镰刀菌菌丝干重分别减少51.27%,40.78%、38.87%和34.58%;菌株B57使茄腐镰刀菌菌丝干重减少71.48%.菌株分泌物对病原真菌的拮抗作用研究结果表明,B57的分泌物对尖孢镰刀菌抑制率最高,3d为82.1%,6d为90.6%;其次是B16,3d为58.8%,6d为51.1%.     

不同来源橡胶树多主棒孢病菌致病性及基础生物学特性的比较

对已在我国海南、云南、广西等省区橡胶树上发生为害的3株多主棒孢病菌(Corynespora cmssiicola)和来自印度的橡胶树多主棒孢病菌进行了致病性及基础生物学特性的比较研究.结果表明,印度HCcYD01菌株的致病力最强;基础生物学特性测定结果表明,参试的3株国内菌株与印度菌株问除分生孢子大小、孢子萌发和致死温度相似外,在菌落形态、最适培养基、光照条件、碳氮源利用、最适生长温度和pH等方面存在一定差异.由多主棒孢引起的橡胶树棒孢霉落叶病业已成为影响天然橡胶产量的主要限制因素,本研究旨在了解我国橡胶树棒孢霉落叶病的最初发病病原,为该病发生规律的研究及防控措施的制定提供理论依据.     

海南橡胶树棒孢霉落叶病病情调查与病原鉴定

报道了我国海南橡胶树棒孢霉落叶病病情调查结果，并通过病害诊断、病原菌基础生物学特性研究和分子鉴定认为，该病的病原为多主棒孢[Corynesporacassiicola(Berkandcurt.)Wei]真菌。     

借助ITS序列用GFP标记巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌

由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。     

木薯根系分泌物与土壤浸出液对橡胶树2种致病菌的化感效果

采用平板试验,通过生长速率法分析木薯根系分泌物及其土壤浸出液对橡胶树白根病病菌及棒孢霉落叶病病菌的化感效果,为判断胶园林下种植木薯的可行性提供理论依据。结果表明：（1）木薯根系分泌物对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均表现为化感促进效果,但在任一处理时间,不同浓度间对白根病病菌的化感效果与对照均未达显著差异,而对棒孢霉落叶病病菌的化感效果呈现明显的剂量效应,浓度达40 mg/mL时,化感促进效果与对照达到显著水平。（2）木薯根系分泌物的任一浓度,对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌的化感效果,在不同处理天数间均未达到显著水平。（3）木薯土壤浸出液对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均呈现化感促进效果,且存在明显的剂量效应;对橡胶树白根病病菌,处理后2 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为40 mg/mL,处理后3 d和处理后4 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为8 mg/mL;对棒孢霉落叶病病菌,在任一处理时间达到显著化感效果的浸出液浓度均至少为200 mg/mL。（4）土壤浸出液小于8 mg/mL时,3个处理时间之间的橡胶树白根病病菌化感效果无显著差异,当浓度达到40 mg/mL时,处理后2 d的化感促进效果显著大于处理后3 d和4 d;4种土壤浸出液的任一浓度,对橡胶树棒孢霉落叶病病菌的化感效果在不同处理时间之间均未达到显著差异。所以说,幼龄胶园间作木薯会在一定程度上促进橡胶树棒孢霉落叶病和白根病的发生。     

土壤嗜铁细菌C19的筛选、分子鉴定及其对炭疽菌和镰刀菌的拮抗作用

利用LB液体培养基进行生物富集,采用CAS(Chrome Azurol S)检测平板法.从海南岛橡胶树等作物根际土壤中分离获得43个产嗜铁索细菌菌株.通过室内平板对峙培养法研究其中嗜铁能力较强的菌株C19对12个常见炭疽菌和镰刀菌的拮抗作用,结果表明.该菌株对Fusarium solani等9个菌株有不同程度的拮抗作用,显示该菌株具有较好的生防潜能.扩增菌株C19的16S rDNA序列,序列测定结果显示,该片段长度为1 525 bp,经Blastn搜索进行序列比对.该细菌为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia).     

六点始叶螨在7个橡胶树无性系上的生物学特性和药效试验

六点始叶螨（Eotetranychus sexmaculatuss）作为橡胶树的重要害螨,对橡胶树的生长发育产生巨大危害,严重影响橡胶树产量。为进一步明确六点始叶螨在不同橡胶树无性系上的发育和繁殖情况,以及不同螨态对杀螨剂的敏感程度。本研究以‘热研87-6-62’‘热研87-6-47’‘热研93-59’‘热研87-4-19’‘热研89-4-51’‘PR107’‘RRIM600’7个橡胶树无性系稳定期叶片作为六点始叶螨的寄主,分析了各螨态的形态特征、发育历期以及繁殖能力。同时,采用浸叶蝶法、叶片残毒法、玻璃浸渍法测定了4种杀虫剂对六点始叶螨各螨态的活性。结果显示,在(28±1)℃、RH(75±5)%、光照[16(L)∶8(D)]条件下,六点始叶螨在以上7个橡胶树无性系上各螨态发育时间从长到短为：成螨期>后若螨→成螨>前若螨→后若螨>卵→前若螨,六点始叶螨各螨态在‘RRIM600’无性系上的发育历期最短,在‘热研87-6-62’和‘热研87-6-47’无性系上的发育历期相对较长;六点始叶螨在7个橡胶树无性系上的单雌产卵量由多到少依次为：‘PR107’>‘RRIM600’>‘热研89-4-19’>‘热研93-59’>‘热研89-4-51’>‘热研87-6-47’>‘热研87-6-62’,其中‘PR107’上单雌产卵量最多,平均单雌产卵量为12.17个,‘热研87-6-62’单雌产卵量最少,平均单雌产卵量为7.33个。筛选不同化学药剂对六点始叶螨进行防效试验,结果表明4种药剂在药后15 d的校正死亡率均在80%以上,其中15%哒螨灵乳油和1.8%阿维菌素·高效氯氰菊酯乳油的速效性较好,在施药3 d后死亡率可达80%以上。     

国内新发危险性橡胶树拟盘多毛孢叶斑病鉴定及其病原学研究

基于目前橡胶树拟盘多毛孢叶斑病在境外主要植胶国爆发流行的态势,以及对天然橡胶产业经济带来的巨大影响。笔者前期对我国海南、云南、广东等省橡胶主产区的13个农场和胶园进行了病害踏查,在我国海南省乐东县志仲镇乐东保显农场发现了疑似橡胶树拟盘多毛孢叶斑病病样。本研究将该疑似病样病原菌进行分离、纯化和致病力测定,并通过形态学和分子系统学分析,确定该病原菌为新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）的Neopestalotiopsis aotearoa Maharachch., K.D. Hyde & Crous;基础生物学特性分析表明,该病原菌菌丝生长和孢子萌发的适宜温度为28℃,孢子致死温度为50℃;适宜pH为6.5,最适碳源为蔗糖和D-葡萄糖,最适氮源为硝酸钾和大豆蛋白胨;最适培养基为PDA,培养8 d后产孢。初步明确了该病的病原及其基础生物学特性,为提前储备防治该病的相关技术措施提供理论依据。     

橡胶树炭疽病生防内生菌的分离鉴定及抑菌作用研究

目前化学农药的缺点日益突显,研发环保的生防菌剂是当前绿色安全的一种方法,筛选具有抑制橡胶树炭疽病的生防菌株,为研发新型生防菌剂储备资源。本文采用组织培养法分离纯化橡胶树内生菌,平板对峙筛选拮抗菌株;通过菌株培养特征、生理生化、根据16S rRNA和gyrA基因序列构建系统发育树确定其分类地位;采用平板对峙法研究内生菌株的抗菌持久性、稳定性、广谱性;采用牛津杯法研究拮抗内生菌对杀菌剂的敏感性。从橡胶树健康的根组织中分离得到4株对橡胶树炭疽病具有抑制作用的细菌（Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4）,系统发育树分析结果显示这4株细菌与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）亲缘关系很近,且培养性状和生理生化特征也与解淀粉芽孢杆菌相似。这4株内生菌的抗菌持久性强,抗菌稳定性好;对尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）DFMP1E和MLZZP3、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）MF375898均有较强的抑菌能力,对茄类镰刀菌（Fusarium solani）XJ160901的抑制作用较弱;对多菌灵、异菌脲、百菌清、苯醚甲环唑4种杀菌剂均不敏感,有望开发为生防菌剂。     

天然橡胶产销动态与发展趋势

根据数年来的观测表明,在生产实践中出现有少量的植株(称其为"超高产橡胶芽接树"),其单株产胶量约达当地普通橡胶芽接树平均单株产胶量的15～20倍.为了探索这些超高产橡胶芽接树高产的原因,笔者对其(砧木为无选择种子砧木,接穗为PB86)根际及立地环境土壤的养分状况,pH值,交换性钙、镁含量,以及土壤酶活性等进行研究.结果表明,超高产橡胶芽接树单株的根际土壤微生态环境(尤其是有机质、速效N含量和土壤酶活性)优于对照株,但其立地环境土壤微生态环境并不优于对照株.