影响根癌农杆菌介导香蕉胚性悬浮细胞遗传转化的因素

用含质粒载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌EHA105转化贡蕉(Musa A A Pisang Mas cv. Mas)品种的胚性悬浮细胞,通过测定GUS基因瞬时表达率,对转化初期的主要影响因素进行了研究。结果表明,取处于对数期的胚性悬浮细胞和D600nm为0.2的菌液混合,在室温、8000r/min离心5min,然后在110r/min的旋转摇床上摇5min,在体细胞胚诱导培养基上共培养8d,瞬时表达率达到最高值25.30%。     

番木瓜均质胚性细胞悬浮系的建立和高效植株再生

【目的】提高番木瓜体细胞胚发生的同步性及其植株再生率,为番木瓜大量快繁、细胞工程和分子育种技术研发提供技术基础。【方法】以紫晖110～120 d果实的未成熟合子胚为外植体,经胚性愈伤组织诱导、液体悬浮培养和体细胞胚发生过程,建立均质胚性细胞悬浮系和高效植株再生技术体系,重点比较了不同质量浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)对胚性愈伤组织诱导、不同质量浓度6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)+萘乙酸(1-naphthlcetic acid,NAA)组合和活性炭(activated carbon,AC)对子叶期体细胞胚萌发与生根的影响。【结果】4 mg·L^-12,4-D可诱导62.86%未成熟合子胚形成胚性愈伤组织。经5个继代周期的筛选培养,可建立由单细胞和小细胞团组成的均质胚性细胞悬浮系。采用液体培养方式能诱导大量球形胚的形成,被转移至含5 g·L^-1AC的半固定培养基成熟培养30 d后,可获得大量子叶期体细胞胚。在含0.4 mg·L^-1<...     

农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立

 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法, 建立了凝望星空百合(Lilium ‘Star Gazer’) 愈伤组织和西伯利亚百合(Lilium ‘Siberia’) 叶片的遗传转化体系。试验结果表明: 以愈伤组织和叶片为受体, 均能取得较理想的转化效果; 根癌农杆菌OD600介于0.5～1.0时, 能获得较高的转化率; 40 mg·L ^{- 1}的潮霉素对愈伤组织和叶片有很好的筛选效果; 在共培养培养基中, 去除NH₄NO₃对提高百合转化效率有极显著的效果。对转基因百合进行PCR检测, 结果表明gus基因已整合到百合基因组中。     

香蕉分生小球体途径胚性细胞悬浮系的建立

 以7 个香蕉品种未成熟雄花为外植体均获得了分生小球体(meristematic globules) 。分生小球体的诱导率因基因组型和品种而异, 为15 %～81 % , 分生小球体的特点及开始出现的时间也受基因组型和品种的影响。以分生小球体为起始材料, 建立了‘广东2 号’、‘华农7 号’及‘河口龙牙’3 个品种的胚性细胞悬浮系, 并通过体胚发生途径获得了前两个品种的再生植株。     

农杆菌介导霞多丽葡萄胚性细胞系遗传转化条件的优化

为建立葡萄(Vitis vinifera)遗传转化技术体系,以霞多丽葡萄(Chardonnay)胚性细胞系为靶组织,采用GUS检测法,对影响农杆菌介导葡萄遗传转化效率的主要因素进行了研究。结果表明,超声波处理时间长短对转化效率有较大影响,在所试的0.5、1、5、10 min 4种不同时间的超声波处理中,以5 min时转化效率较好,平均达到9.11个蓝色斑点;AS浓度对转化效率有明显差异,当浓度为50μmol/L时,平均蓝色斑点数为8.89个,100μmol/L时,达到12.44个;DTT质量浓度对转化效率也有较大影响,在所试的3种质量浓度(1,2,3 mg/L)中,以3 mg/L为最佳,有16.67个蓝色斑点。通过GUS瞬时表达检测,确立了农杆菌介导葡萄胚性细胞系遗传转化的几个最适影响因素,从而为葡萄遗传转化技术体系的建立奠定了基础。     

农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立

以南瓜金辉一号（Cucurbita moschata‘Jinhui1’）为实验材料,利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化南瓜子叶节,研究了预培养时间、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度和共培养时间,     

利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究

以纵切的野生阿宽蕉60d龄未成熟种子为外植体,在MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养60d后开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为(15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含18μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。     

根癌农杆菌介导荔枝遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因(uidA)的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导荔枝胚性愈伤组织遗传转化的若干因素。结果表明:在AGL-1、LBA4404和EHA105三种菌株中,EHA105对荔枝胚性愈伤组织的侵染力最强;采用2d的共培养时间既有较高的瞬时表达率,又避免了农杆菌的过度生长;0.5×10~8个细胞/mL的菌液密度为最佳侵染浓度;继代培养15d的胚性愈伤组织处于最旺盛分裂的时期,是转化的合适受体;愈伤组织转化前干燥处理对uidA瞬时表达率的提高有一定的促进作用。使用优化的农杆菌侵染条件获得了稳定表达uidA基因的荔枝抗性愈伤组织。     

香蕉胚性细胞悬浮系玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性分析

采用玻璃化法对3个香蕉栽培品种（Musa spp. AAA）的胚性细胞悬浮系（ECS）进行超低温保存。对超低温保存程序进行优化,冻存后进行ECS重建并通过体细胞胚发生途径进行植株再生,最后对再生植株进行遗传稳定性分析。用建立的ECS玻璃化法超低温保存程序对 ‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’和‘粤优抗1号’的ECS进行超低温保存,获得的细胞相对存活率分别为89.6%、90.9%和89.9%,并重建了‘北大矮蕉’的ECS;在冻存后体细胞胚发生途径植株再生过程中,3个品种的相对植株再生率分别为64.4%、0.9% 和14.0%。从冻存后‘巴西蕉’ECS获得的细胞胚发生途径再生植株的遗传稳定性分析结果表明：再生植株与对照在形态学方面无明显区别;简单序列重复区间（ISSR）分子标记也显示与对照相比基本无差异带出现,这初步表明超低温保存后的香蕉ECS保持了遗传稳定性。     

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的若干因素。结果表 明:西瓜子叶块外植体对潮霉素较为敏感,15 mg/L是适宜的筛选浓度,可明显抑制非转化组织的生长;脱菌过程中 采用500 mg/L的头孢霉素,对外植体生长影响较小;农杆菌菌株EHA105对西瓜子叶块的侵染能力较强;预培养有 利于转化;共培养3-4 d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600值为0.3的菌液侵染10min效果最 佳;共培养培养基中添加乙酰丁香酮可提高转化频率。     

沙田柚遗传转化的探讨

采用含ｎｏｓ基因和人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因ＡＰ－Ｄ基因的根癌农杆菌对沙田柚外植体进行转基因研究,与根癌农杆菌共培养产生的芽,苗经Ｋｍ敏感性筛选,获得了若干转基因植株,并对这些植株进行了报告基因ｎｏｓ表达的电泳检测,同位素标记、ＡＰ－Ｄ基因为探针的点印迹杂交,外源ＡＰ－Ｄ基因的ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交。结果显示,报告基因ｎｏｓ、抗菌肽Ｄ基因已转入沙田柚植株细胞中。     

红姜花胚性细胞悬浮体系的建立和原生质体培养

以红姜花(Hedychium coccineum)未成熟花丝和花药为试材,研究了红姜花胚性愈伤组织的诱导、细胞悬浮体系的建立以及原生质体的培养。结果表明:在MS+4mg/L 2,4-D+4mg/L NAA+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂上经过120d培养诱导出了愈伤组织,愈伤组织在增殖培养基上经过继代筛选获得浅黄色、松散易碎的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织通过3个月的悬浮培养,得到均质稳定的胚性细胞悬浮系。以胚性悬浮细胞(ECS)为起始材料分离原生质体,酶解试验表明,在原生质体分离过程中,用于原生质体分离的酶液需要保持一定的渗透压以保护原生质体不被破坏。当甘露醇的浓度为0.14mol/L时,原生质体产量最高,达到2.25×105个/mL PCV ECS(packed cell volume,PCV)。在看护培养系统中,原生质体经过7d的培养,细胞第一次分裂,经过14d培养,细胞分裂频率达到12.3%,28d时,细胞团形成频率达到4.2%。所形成的细胞团具有典型的胚性细胞特征。     

四川‘竹根姜’胚性细胞悬浮系的建立与植株再生

 选用四川省地方品种‘竹根姜’的茎尖组织建立了体细胞胚性细胞悬浮系, 并通过悬浮培养获得了姜再生植株。结果表明悬浮细胞干质量受pH影响。接种量和AgNO₃ 对悬浮细胞的生长都有影响:最佳接种量为1.0% , 最适AgNO₃浓度为6.0 mg·L ^{- 1}。胚性细胞悬浮系增殖后, 接种到前期筛选的成熟分化培养基上获得了再生植株。     

阔叶猕猴桃遗传转化技术参数的优化

为了提高阔叶猕猴桃的遗传转化效率,以阔叶猕猴桃叶柄为试材,通过根癌农杆菌介导法进行了遗传转化技术参数的研究。结果表明,叶柄预培养3～4d、用农杆菌悬浮液(D600nm值0.5)感染10min、共培养48h、共培养时在培养基中加入200μmol/L乙酰丁香酮处理可以获得较高的gus基因表达率。在供试的1200个叶柄中获得了49个抗性芽,转化频率为4.1%。对转基因抗性材料进行PCR检测和gus基因组织化学染色,证实了外源基因已整合到阔叶猕猴桃的基因组中,并得到稳定表达。     

农杆菌介导的黄瓜遗传转化的影响因素

以"津优1号"黄瓜子叶节为外植体试材,研究了外植体苗态、乙酰丁香酮(AS)浓度、脱菌次数、头孢霉素(Cef)浓度及生根培养基等因素对遗传转化的影响,以期为开展黄瓜的遗传转化研究提供参考依据。结果表明:使用子叶抱合类外植体诱导分化效果最好;在预培养基和共培养基中添加100μmol·L~(-1) AS有利于外植体分化;用无菌水冲洗3次可有效控制农杆菌污染;选择培养基中添加300μmol·L~(-1) Cef,生根培养基中添加400μmol·L~(-1) Cef在抑制农杆菌的同时可有效促进根系生长。     

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究进展

介绍了根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的研究现状,综述了西瓜高效再生体系的建立和遗传转化过程中的主要影响因素,包括最佳外植体的选择、最适培养基的制备,以及抗生素、农杆菌菌株类型、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间和添加乙酰丁香酮等内容,讨论了西瓜遗传转化存在的问题,并对这一体系的发展进行了展望。     

根癌农杆菌介导的韭菜基因转化体系的建立

 以GUS 基因为报告基因, 建立了农杆菌介导的韭菜基因转化体系。研究结果表明, 以预培养4～6 d 的根尖为转化受体, 用OD₆₀₀0. 6 ～0. 8 的LBA4404 浸染2～5 min , 共培养2 d , 然后在MS + NAA1 mg/L + BA 2 mg/L + Km 25 mg/L + Timentin 400 mg/L + As 100 mg/L 培养基上培养40 d , 后有愈伤组织产生,转入光下培养20 d 后有少量绿色不定芽产生。经X-Gluc 染色、PCR 分析和Southern blot 检验, GUS 基因已经整合到韭菜基因组染色体上。     

‘霞多丽’胚性细胞悬浮系的建立及植株再生

以‘霞多丽’前胚物质为试材,初步建立了‘霞多丽’胚性细胞悬浮系,并研究了不同激素及其浓度配比,不同种类及浓度的碳源以及谷氨酰胺对悬浮细胞生长的影响.结果表明:2,4-D和NOA均可以抑制胚性细胞的分化,但2,4-D更有利于细胞的增殖,最佳的2,4-D附加浓度为1 mg/L.同等浓度(0～60 g/L)的麦芽糖比蔗糖更利于细胞的生长,15 g/L为‘霞多丽’胚性悬浮细胞生长的最佳麦芽糖浓度.附加谷氨酰胺可以显著提高悬浮细胞的生长,其中以500 mg/L为最佳.     

结球甘蓝自交系YL-1的高效遗传转化体系的建立及应用

为了筛选结球甘蓝高效遗传转化受体材料,以高代自交系YL-1、21-3、12J35、650为试材,比较不同材料具柄子叶和下胚轴的再生频率差异。在4份供试材料中,YL-1为最优转化受体,再生频率显著高于其他3份材料;YL-1具柄子叶和下胚轴的再生频率无显著差异,均可用于遗传转化。进一步对YL-1遗传转化过程中光照强度、Basta除草剂浓度、农杆菌侵染浓度等关键影响因素进行优化,发现光照强度为4 000 lx时更有利于不定芽诱导;除草剂最适筛选浓度为8 mg·L~(-1);农杆菌侵染浓度OD600=0.3侵染8 min,YL-1抗性芽再生频率最高。基于建立的高效遗传转化体系,共获得47株抗除草剂植株,PCR检测显示其中12株为阳性,初步表明bar基因已转化到甘蓝中,转化率达到2.18%。利用转录组测序技术对2株PCR阳性材料进行基因表达分析,均检测到bar基因高效表达。甘蓝高代自交系YL-1高效遗传转化体系的建立可为今后结球甘蓝基因功能鉴定及重要农艺性状的改良提供基础。     

绿色荧光蛋白基因转化柑橘胚性愈伤组织与高效再生

采用根癌农杆菌介导法对13份柑橘胚性愈伤组织进行绿色荧光蛋白基因(gfp)的转化,短时间内获得了温州蜜柑、橘橙杂种GWZ等11份柑橘材料的82个转化细胞系,其中佛罗斯特脐橙和日辉橘最易转化,分别获得28个和25个转化细胞系。选取3份材料的不同转化细胞系进行gfp的PCR分析,均获得了预期的gfp片段。研究表明,GFP标记可以在转化早期快速检测并分离转化子,及时剔除逃逸体,获得纯合的转化系;高水平的gfp表达不影响转化细胞增殖、生长和分化。这些带有GFP标记的转化细胞系为柑橘的有关基础研究提供了良好的试材,目前正用于柑橘体细胞杂交和不同倍性愈伤组织的社会化控制现象与机理等研究。