白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

荔枝铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与序列分析

以"三月红"荔枝基因组DNA为模板,用Cu*ZnSOD基因特异寡聚核苷酸为引物,进行PCR扩增,得到特异基因片段,将其克隆到pGEMT载体上,转化感受态大肠杆菌TG1中,对转化子中重组pGEMT上的Cu*ZnSOD基因片段的PCR扩增检测和序列分析,表明克隆成功;该基因片段有478个核苷酸,由4个外显子和3个内含子组成;外显子由234个核苷酸组成,编码78个氨基酸;该基因片段编码的氨基酸序列与水稻、玉米、番茄、大白菜和松树的Cu*ZnSOD基因编码的氨基酸序列的同源性分别为79.5%、73.1%、73.1%、71.8%和75.7%.     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增,从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2 361 bp的DNA片段,该DNA克隆含有1个2 081 bp的LEAFY同源基因全长序列(FcLFY)。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子,编码398个氨基酸。比对结果表明,金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98%。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

黄瓜、西瓜、南瓜EIN3基因片段的克隆与序列分析

EIN3（Ethylene insensitive 3）是位于细胞核的核蛋白为乙烯信号转导的下游调控基因,根据GenBank所报道的植物EIN3基因mRNA的保守序列设计两个引物,以黄瓜、西瓜、南瓜总DNA为模板PCR扩增到3个725bp的基因片段，将片段序列在NCBI数据库中Blastn同源搜寻，显示151条有同源性的序列全部是EIN3基因，因此推断克隆的3个片段均为EIN3基因家族成员。NCBI网站的ORF Finder找到正确的开放式阅读框，翻译成为氨基酸序列，对CsEIN3、ClEIN3及CmEIN3氨基酸序列在NCBI网站进行Blastp比对, 在大分子结构数据库MMDB (Molecular Modelling Database) 搜索,3个推测蛋白保守结构域三级结构与拟南芥EIN3的DNA结合域(MMDB: 30598 PDB: 1WIJ )完全相同，系统进化分析表明，黄瓜、西瓜、南瓜与双子叶植物甜瓜、绿豆、蒺藜状苜蓿、烟草、番茄、拟南芥及单子叶水稻、桃红蝴蝶兰等的EIN3家族成员都有较高的相似性。     

PR—1a蛋白基因的克隆及序列分析

以珊西烟草（Nicotina tabacum cv. Xanthi-nc）的基因组DNA为模板，通过合成一对特异性引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得PR－1a蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明：该基因由504个碱基组成，编码168个氨基酸。与已发表序列相比较，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和100％。     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

长穗偃麦草HKT1;4基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物高亲和钾离子转运蛋白（HKT1;4）基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出长穗偃麦草HKT1;4,基因命名为EeHKT1;4。结果表明：该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,所得序列与其他植物氨基酸序列同源性均在80%以上,特别是和一粒小麦TmHKT1;4氨基酸同源性高达92%。这为长穗偃麦草HKT1;4全长基因的克隆及其耐盐分子机制的研究奠定基础。     

旱生植物梭梭actin基因片段的克隆及表达模式分析

本研究根据其它植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以3周龄梭梭整株总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明：该片段长约598 bp,编码198个氨基酸;该序列与GenBank中现有的植物Actin比对发现,同源性均高达84%,同时,翻译得到的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列同源性高达99%。表达实验分析表明在不同胁迫条件下该基因在梭梭不同组织中表达量恒定,可作为内参基因。梭梭actin基因片段的克隆可为研究重要抗逆功能基因在梭梭中的表达和调控机制奠定基础。     

油菜叶片衰老相关基因的分离细胞色素P450 cDNA的克隆和序列分析

通过绿叶和衰老叶片cDNA的缩减杂交和差别筛选,富集并分离了缩减cDNA文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段.以目的基因片段为探针,通过筛选油菜衰老叶片的cDNA文库,分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长cDNA LSC46.DNA序列分析结果表明,LSC46可读框架全长由1509个碱基组成,可以编码503个氨基酸残基,它的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与拟南芥菜依赖于单加氧酶的细胞色素P450的相应序列相比,分别有84.23%和83.50%的同源性.     

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。     

高羊茅甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因FaGAPDH的克隆与分析

以高羊茅茎基部与叶基部的mRNA为模板,引用基于多年生黑麦草GAPDH基因序列设计的引物,进行RT-PCR分析,同时结合3＇RACE和5＇RACE方法从高羊茅中扩增出两个GAPDH基因,命名为Fa-GAPDH1（GQ480772）与FaG4PDH2（GQ480773）。两序列cDNA全长分别为1281bp和1348bp,具有完整的开放阅读框（ORF,FaGAPDHI：74～1087bp;FaGAPDH2：106～1119bp）,编码蛋白都为337个氨基酸。保守结构域功能分析表明两基因编码的蛋白质都具有典型的Rossman—NAD连接折叠和C-末端结构域。FaGAPDH1和FaGAPDH2蛋白与禾本科植物的该基因蛋白产物比较发现氨基酸序列的同源性都在90％以上,说明两基因具有高度的保守性。     

黄瓜、西瓜和南瓜EIN3基因片段的克隆与序列分析

EIN3(ethylene insensitive 3)位于细胞核的核蛋白,为乙烯信号转导的下游调控基因,根据GenBank植物EIN3基因家族的保守序列设计了1对引物,以黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)和南瓜(Cucurbita maxima)总DNA为模板PCR扩增到3个725bp的基因片段CsEIN3、ClEIN3和CmEIN3,并提交GenBank,登录号分别为AY973275、DQ023225和DQ023224。将片段序列在NCBI数据库中Blastn同源搜寻,显示151条有同源性的序列全部是EIN3基因。NCBI网站的ORF(open reading frame)Finder找到正确的开放式阅读框,翻译成为氨基酸序列,对CsEIN3、ClEIN3及CmEIN3氨基酸序列在NCBI网站进行Blastp比对,在大分子结构数据库(molecular modelling database,MMDB)搜索,3个推测蛋白保守结构域三级结构与拟南芥EIN3的DNA结合域(MMDB:30598;PDB:1WIJ)完全相同,系统进化分析表明,黄瓜、西瓜和南瓜与双子叶植物甜瓜、绿豆、蒺藜状苜蓿、烟草、番茄、拟南芥及单子叶水稻、桃红蝴蝶兰等的EIN3家族成员都有较高的相似性。     

小麦TaKu70和TaKu80基因的克隆和分析

Ku蛋白与动植物细胞DNA损伤修复和辐射敏感性有着密切联系,其功能及表达正常与否,关系到细胞DNA双链断裂（DSBs）的修复能力。为了研究Ku蛋白在小麦DNA损伤修复和对辐射敏感性中的作用,本实验室克隆了完整的小麦Ku70和Ku80 cDNA 序列,分别命名为TaKu70和TaKu80。小麦TaKu70和TaKu80分别编码626个和706个氨基酸残基的Ku70/Ku80蛋白序列。多重序列分析表明小麦Ku70蛋白与水稻和拟南芥Ku70蛋白的同源性分别为94%和78%;小麦Ku80蛋白与水稻和拟南芥Ku80蛋白的同源性分别为85%和69%。结构域和功能分析表明小麦Ku70/Ku80蛋白含有Ku蛋白的核心组分——Ku70/ Ku80-core结构域,以及只有真核生物Ku蛋白才有的vWA 结构域。     

高羊茅细胞色素FaP450基因克隆及其在非生物胁迫下表达分析

细胞色素P450属于一种含亚铁血红素单加氧酶的超基因家族,在植物多种代谢途径与防御反应中起着重要作用。为探究细胞色素P450基因在高羊茅中的表达模式,本研究采用cDNA末端快速扩增技术从高羊茅叶片中克隆了细胞色素P450基因,命名为FaP450。FaP450全长1 737 bp,含1 437 bp的开放阅读框,共编码478个氨基酸,具有P450基因家族典型的P450结构域。系统进化树分析表明,高羊茅FaP450与禾本科植物小麦、山羊草的P450蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR表明,高羊茅FaP450基因受干旱、高温、氮胁迫及盐胁迫的诱导表达上调,表明该基因与非生物胁迫的抗性相关。构建FaP450超量表达载体,利用农杆菌侵染法转化拟南芥,对其进行低氮胁迫,发现低氮胁迫下FaP450基因过量表达植株的鲜重与根长显著高于野生型,表明FaP450基因的超量表达可以增强拟南芥对低氮的适应性。本研究为深入探索P450基因家族在牧草生长发育与抗逆功能的研究奠定了理论基础。     

Tall fescue aluminum tolerance is affected by neotyphodium coenophialum endophyte

Roots of endophyte‐infected (E+) tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.) exude more phenolic‐like reductants than roots of endophyte‐free (E‐) plants when mineral stressed. Phenolic compounds are efficient chelators of aluminum (Al) and may influence Al tolerance in many plant species. The objective of our study was to determine if enhanced release of phenolic compounds by roots of E+ plants contributes to Al tolerance in tall fescue. Two cloned genotypes (DN2 and DN11) of tall fescue infected with their naturally occurring fungal endophyte Neotyphodium coenophialum (Morgan‐Jones and Gams) Glenn, Bacon and Hanlin and their noninfected isolines were grown in nutrient solutions at 0 μM Al (Al‐) and at 640 μM Al (Al+) under controlled environment conditions. Root and shoot dry matter (DM) of endophyte‐infected tall fescue was greater in E+ than E‐ plants by 57% and 40%, respectively, when plants were grown without Al. Endophyte infection did not affect root and shoot DM of tall fescue grown with Al but relative (to Al‐treatment) reduction in root and shoot DM was greater in E+ than E‐ plants. In response to Al stress, more Al (47%) and P (49%) could be desorbed from root surfaces of E+ than E‐ plants. Aluminum concentrations in roots of E+ plants were 35% greater and P concentrations were 10% less than those determined in roots of E‐plants. No differences in mineral concentrations were observed in shoots, regardless of endophyte status, or Al level in nutrient solution. Roots of E+ plants increased pH of both Al‐ and Al+ nutrient solutions to a greater extent than roots of E‐ plants in a 48 h interval. Our results show that more Al can be sequestered on root surfaces and in root tissues of endophyte‐infected tall fescue than in plants devoid of endophyte. Aluminum sequestration was greater on root surfaces and in root tissues of E+ than E‐ plants of a given tall fescue genotype. Our results suggest that increased exudation of phenolic‐like compounds from roots of endophyte‐infected tall fescue may be directly involved in Al tolerance and serves as a mechanism for widespread adaptability and success of endophyte‐tall fescue associations.