木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因启动子的克隆及激素应答表达分析

为了解木薯碱性/中性转化酶基因MeNINV1对激素的应答模式及调控机制本研究采用PCR技术,从木薯基因组中分离出MeNINV1基因启动子序列。分析结果显示该启动子长度1 714 bp,含有TATA box和CAAT box保守元件,以及四个激素响应元件:ERE(乙烯应答)、ABRE(ABA应答)、TAC-element(SA应答)和P-box(GA应答)。根据启动子上存在的参与激素应答相关的顺式作用元件信息,选用30μmol/L GA3、30μmol/L ABA、100μmol/L SA和1%乙烯利四种外源激素胁迫处理木薯SC8组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeNINV1基因在不同激素处理下的表达模式。结果表明,MeNINV1基因的表达受激素的调控,因此推断碱性/中性转化酶基因MeNINV1启动子上的激素应答元件响应激素诱导,调控基因的表达。研究结果为进一步研究激素信号如何调控木薯块根蔗糖的分解代谢提供理论基础。     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

木薯EIN3基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性

木薯是一种重要的能源和淀粉作物,具有较强的抗逆性和耐贫瘠等能力。为研究木薯中EIN3基因如何被逆境信号调控,对木薯基因组数据库中的EIN3基因进行了序列分析,表明其具有典型的EIN3-like protein DNA结合结构域;其启动子区具有茉莉酸响应元件等多种响应元件。本研究以木薯品种"华南八号"悬浮培养细胞为材料,利用q RT-PCR检测木薯EIN3基因在乙烯利和茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示:EIN3在乙烯处理后,基因表达在8 h内呈现持续上升趋势;而茉莉酸甲酯处理后则整体呈现先上升后下降的趋势,且在2 h基因表达量最大。说明EIN3基因可被乙烯和茉莉酸信号调控,并推测其可受不同激素信号的整合后的综合调控,可参与到植物体内一系列多种生理生化过程。     

水稻LysM结构域包含基因OsEMSA1的克隆及过表达株系构建

LysM结构域包含蛋白(lysM domain containing protein)为植物中公认的病原菌信号受体蛋白。本研究在水稻雌性不育基因FST遗传调控网中筛选获得一个关键靶基因,暂命名为OsEMSA1,该基因编码包含一个LysM结构域的未知功能蛋白质。蛋白质序列分析表明,OsEMSA1蛋白N端包含一个信号肽序列,具备跨膜结构,LysM结构域位于蛋白C端,为胞外结构。启动子顺式作用元件分析表明,光响应元件、激素应答元件、生长调节元件在OsEMSA1启动子区有很高的分布。电子表达谱分析表明,OsEMSA1基因在野生型水稻日本晴多组织中均有不同程度的表达,而根中和开花前的胚囊中表达量相对较高,可能参与调控水稻根和雌配子发育,同时逆境胁迫、激素信号以及病菌侵害也能不同程度的诱导OsEMSA1基因的表达。基因共表达分析显示,OsEMSA1基因与激素信号传导响应、逆境胁迫应答以及抵御真菌病害的基因存在互作。本研究成功构建了由OsEMSA1基因自身启动子驱动的过表达转基因水稻株系,为进一步分析OsEMSA1基因功能奠定了实验基础,并为发掘LysM结构域包含蛋白的潜在功能提供了一定的理论依据。     

ERF转录因子对生物胁迫的反应及对棉花抗性改良的意义

大量研究表明植物中ERF(ethylene responsive factor)类转录因子广泛参与外界环境胁迫应答基因表达的调控.它编码的蛋白能够特异结合GCC-box元件,从而调控启动子含有GCC-box的病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病反应中发挥重要的调控作用.棉花中ERF基因表达受生物和非生物胁迫诱导,并在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用.一些ERF基因在转基因植物中的超表达表现出了一定的广谱抗性,因而在棉花分子育种中具有较为广阔的应用前景.本文主要论述了棉花等植物中ERF的结构与功能特征,当前相关研究进展,及其对棉花抗病性分子遗传改良的意义.     

木薯转录因子基因MeHDZ14的克隆与分析

HD-Zip家族基因在植物生长发育和逆境胁迫中起重要作用。为了研究MeHDZ14基因在非生物胁迫(尤其是干旱)应答中的作用,选用对干旱信号反应灵敏、相对耐旱的木薯品种"SC124"作为实验材料,利用RT-PCR克隆了MeHDZ14基因。生物信息学分析发现,MeHDZ14基因编码的蛋白具有典型的HD-Zip保守结构域。将该基因编码的蛋白与GFP融合,亚细胞MeHDZ14:GFP重组蛋白定位于细胞核。同时,酵母Y187中的转录自激活试验结果也表明,MeHDZ14蛋白具有明显转录自激活功能。推断MeHDZ14是一个典型的HD-Zip I转录因子。MeHDZ14启动子区具有多个ABA响应元件ABRE(ABA response element)。基因差异表达分析结果表明,MeHDZ14基因在叶片和根中的表达受干旱胁迫的诱导,并对外源ABA具有明显的响应。因此,认为MeHDZ14基因通过ABA依赖信号传导途径参与调控木薯干旱响应。此外,还发现MeHDZ14基因的编码区虽然存在数个SNP,但表现出高度保守性,且在不同木薯品种中的表达对干旱胁迫均有明显的响应,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

大薯病程相关蛋白1(PR1)基因及其启动子序列的克隆与分析

为了研究大薯Da PR1基因的表达模式及调控机理,本研究利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从高抗炭疽病大薯材料Da94中获得1个病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PR1)基因,命名为Da PR1。测序显示该基因包含长度为501 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码166个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有典型SCP-PR1-like保守结构域,Blast比对表明Da PR1蛋白与多种植物的PR1蛋白高度同源。实时荧光定量PCR检测表明,Da PR1基因在高抗种质中受炭疽菌显著诱导,在侵染48 h时其相对表达量达到最大。通过巢式PCR扩增Da PR1上游转录调控序列的5'端,获得1 203 bp的Da PR1基因启动子,序列分析表明该区域除了含有基础的启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还存在茉莉酸(JA)、赤霉素(GB)等激素响应元件及真菌诱导响应元件(W-box)。本研究通过克隆和分析Da PR1基因及其启动子序列,为进一步研究该基因的功能及其表达调控机制奠定了基础。     

拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。     

西瓜BADH基因序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性

甜菜碱作为植物体内一种重要的渗透调节物,对调节逆境下植物细胞的渗透压起着十分重要的作用,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)在植物甜菜碱合成过程中起了关键的催化作用。本研究中,通过分析西瓜BADH基因的结构和功能,结果表明:ClBADH基因启动子区结构中含有15个外显子和14个内含子,其含有包括乙烯响应元件在内的20多种顺式响应元件;ClBADH基因编码的蛋白含有503个氨基酸,该蛋白分子量约为54.5 kD;蛋白亚细胞定位预测显示其可能定位在细胞质中,具有氧化还原酶活性。通过对系统进化树的分析发现西瓜在同源关系上与同科的黄瓜和甜瓜更近,而与藜科的甜菜的同源关系相对较远。此外,以茉莉酸甲酯和乙烯两种物质模拟逆境信号处理西瓜细胞,发现两种信号物质诱导后,西瓜ClBADH基因的表达量均有上调的趋势,但其上调的速度和幅度却存在明显的差异。本研究为通过逆境信号诱导提高西瓜抗逆性提供参考,也为利用基因工程技术提高西瓜抗逆性提供支持。     

植物逆境诱导启动子mwcs120的克隆及表达特性研究

以小麦基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆逆境诱导表达启动子mwcs120。序列分析表明,该启动子与冷诱导启动子wcs120的序列同源性为97.1%,有2个位点发生了突变,但逆境调控保守元件的序列未发生改变。瞬时表达实验表明,在单子叶和双子叶植物中,mwcs120启动子均受低温和高盐逆境诱导,使GUS基因的表达增强。因此,mwcs120启动子在作物抗逆基因工程中具有较好的应用前景。     

樱桃番茄Cf9基因调控元件预测及同源基因系统发育分析

为探明Cf9基因的表达调控元件和同源基因进化关系,从樱桃番茄品种京番红星中克隆了Cf9上游序列,利用PlantCARE启动子预测工具对转录起始位点上游1500 bp序列进行顺式调控元件分析。结果表明,Cf9启动子不仅含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,而且含有光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件等。Cf9基因可能受光、水杨酸和茉莉酸甲酯等诱导表达。Cf9同源基因系统进化分析结果表明,当同源指数为0.65时,番茄、马铃薯、辣椒、烟草中含有Cf9同源基因,同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因,分析结果也进一步说明番茄与马铃薯的亲缘关系最近,其次为辣椒、烟草。     

优质面包小麦品种济南17和豫麦34灌浆期高温胁迫差异表达基因的分离

选用品质相对不稳定的小麦品种济南17和品质较稳定的品种豫麦34,于开花后15~18 d（灌浆中期）及30~33 d（灌浆后期）分别进行连续3 d的高温胁迫处理（昼夜温度为38℃,25℃）。提取籽粒总RNA,通过cDNA-AFLP分析获得差异条带。回收差异条带,再经过克隆、测序、BLAST比对,济南17、豫麦34分别获得85个和99个高温胁迫下差异表达基因片段的序列。经过反向Northern杂交验证后,济南17获得25个信号明显的序列,其中22个来自热诱导表达的基因,主要与小麦的胁迫响应基因、热激蛋白等同源;豫麦34获得31个信号明显的序列,其中25个来自热抑制表达的基因,主要与乙烯合成酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶等同源。说明高温胁迫总体上诱导品质不稳定品种的基因表达,而抑制品质稳定品种的基因表达。济南17的序列有15个来自灌浆中期样本、10个来自灌浆后期样本,豫麦34的序列则分别有29个来自灌浆中期样本、2个来自灌浆后期样本,说明高温胁迫对灌浆中期基因表达的影响比灌浆后期显著,在品质稳定品种中则比品质不稳定品种中更为明显。2个品种在高温胁迫下的基因表达模式存在显著差异,济南17诱导表达胁迫响应基因,豫麦34抑制表达乙烯合成酶和吡咯啉-5-羧酸合成酶及胁迫响应基因,这可能是二者品质稳定性不同的重要原因。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

白桦W-box元件的载体构建及驱动GUS基因表达分析

植物体内的启动子含有多种顺式作用元件,通过调控下游基因的表达,影响植物的生长发育。本研究以白桦中含有BplMYB46启动子的质粒为模板,将含有W-box元件的启动子短片段克隆出来,经过酶切、连接和热激转化到大肠杆菌中。经过PCR检测及测序分析,结果表明pCAMBIA1301-W-box-GUS重组载体构建成功。获得工程菌后,瞬时侵染烟草后进行GUS染色,结果显示,烟草叶片能被染色,但颜色较浅,说明W-box元件能够驱动GUS基因表达,但驱动能力较低。本研究为后续分析上游转录因子与W-box顺式作用元件的互作以及筛选诱导型启动子从而改良白桦品质提供前期基础数据。     

甜瓜ACS基因家族成员的鉴定及其表达特性分析

乙烯在高等植物生长发育等多个方面都具有重要的调控作用,而ACS(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)synthase,1-氨基环丙烷-1羧酸合成酶)是乙烯生物合成途径的限速酶,由多基因家族编码,不同的发育、环境、激素刺激等信号诱导不同的ACS基因表达.本研究以甜瓜品种'河...     

甘薯香豆酸3'-羟化酶基因的克隆和表达分析

香豆酸3'-羟化酶(coumarate-3-hydroxylase,C3H)是绿原酸代谢途径中的关键酶之一。为了揭示甘薯绿原酸生物合成途径和挖掘绿原酸合成相关基因,本研究从甘薯中克隆一个C3H的同源基因IbC3H。该基因全长1656 bp,包含一个1530 bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸。IbC3H蛋白具有典型P450家族蛋白结构特征,与牵牛花(Ipomoea nil)、马铃薯(Solanum tuberosum)、浆果状椒(Capsicum baccatum)和烟草(Nicotiana attenuate)中相应蛋白的同源性分别达到97.2%、85.4%、84.8%和84.8%。IbC3H启动子序列中含有脱落酸、赤霉素、乙烯和干旱等多个激素和胁迫响应元件,以及髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(MYB)、碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)、和WRKY蛋白等转录因子结合元件。荧光定量PCR结果显示,IbC3H在甘薯叶片中表达量最高,在茎中次之,而在块根中的表达量最低,与甘薯不同组织绿原酸含量正相关。本研究结果为进一步揭示IbC3H在绿原酸生物合成中的功能提供了依据。     

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。     

水稻稻瘟病抗病基因Pi63顺式作用元件的载体构建

水稻稻瘟病抗性基因Pi63具有良好的田间抗性,且抗性与其表达量成正相关,但Pi63表达的调控机制尚未得到研究。为了研究Pi63的抗性机理,通过对Pi63启动子区域顺式作用元件的生物信息学分析,分段构建了4个含有不同顺式作用元件的缺失体,将上述缺失体转入植物双元表达载体pCAMBIA1391Z中。菌落PCR以及质粒DNA酶切鉴定后,经测序进一步确认。结果表明：以上4个缺失体载体构建成功。本研究为进一步研究启动子中不同顺式作用元件对于Pi63基因稻瘟病抗性的影响以及Pi63基因的表达特性奠定了基础。