尖孢镰刀菌亚麻专化型Folcdc15基因参与调控分生孢子发生和菌丝生长

通过对尖孢镰刀菌亚麻专化型Folcdc15基因敲除及敲除突变体互补试验，探究该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。对Folcdc15基因进行DNA测序后，使用Split-Marker技术，构建含有潮霉素抗性基因(hph)缺失盒。通过PEG介导法转入野生型原生质体，在含有潮霉素的选择培养基上进行转化子筛选，通过PCR正负筛选确定敲除突变体。利用pZWH1载体构建含有Folcdc15的互补载体pZLY1,将其转入敲除突变体中进行互补测验。与野生型hm相比，敲除突变体ko1菌落生长速率下降了73%,菌丝形态发生了显著改变，菌丝变短且分叉变多，分生孢子隔膜数量增多长度增加，分生孢子数量显著减少。亚麻侵染试验表明，ko1的致病力显著降低。通过互补测验发现，回复突变株ca1恢复了Folcdc15基因缺失带来的分生孢子产量及形态、菌落生长和形态及致病力的缺陷。Folcdc15参与调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的分生孢子发生及菌丝生长。     

棉花黄萎病菌VdSge1基因的敲除与功能分析

为了明确棉花黄萎病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的VdSge1基因功能,本研究利用基因同源重组原理,通过构建敲除载体,对棉花黄萎病菌落叶型强致病力菌株V592的VdSge1基因进行了敲除,获得了4个目标基因敲除的突变体;以野生型菌株V592为对照,通过对敲除突变体生物学性状和致病性测定,结果表明,突变体的菌落生长速度、产孢量明显高于野生型,并且丧失对棉花的致病性。利用q RT-PCR对其他基因在突变体中的表达情况进行分析,结果表明,VdSge1基因敲除后,VMK1、VGB和VdGARP1的表达量随之下降,而VDH1和PevD1的表达却明显上升。由此说明,VdSge1基因与大丽轮枝菌的菌落生长速度、产孢量及致病性密切相关,并且可以影响其他一些基因的表达。     

小麦赤霉菌FGSG_08948基因敲除及功能研究

旨在敲除小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)FGSG_08948基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。应用Split-Marker技术敲除FGSG_08948基因,构建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒,利用PEG介导法进行原生质体转化。在含有潮霉素的培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛选,得到2个确定的敲除突变体,分别命名为△FGSG_08948 1-1、△FGSG_08948 1-2。表型观察发现:敲除突变体的菌落形态无明显差别,菌落生长速度略微滞后,孢子形态无差别,致病力无减弱,但产孢量有所上升。因此,FGSG_08948基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关。     

棉花黄萎病菌鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白基因VdOAZ的功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌中鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白(OAZ)基因(VdOAZ)的功能。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdOAZ基因全长进行克隆并测序。构建针对VdOAZ基因的敲除载体和互补载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdOAZ基因敲除菌株和和互补菌株。以野生型菌株V592为对照,对VdOAZ基因敲除突变体和互补菌株的菌落生长速率、产孢量、微菌核产量及对棉花的致病力进行测定;通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应测定致病相关的其他基因在VdOAZ基因敲除突变体中的表达量,及亚精胺诱导条件下,V592菌株中VdOAZ基因及致病相关的其他基因的相对表达量。【结果】从棉花黄萎病菌中克隆到VdOAZ基因的全长为1 006 bp,具有2个开放阅读框(Open reading frame,ORF),ORF2编码的蛋白具有OAZ所特有的ODC-AZ保守结构域。与野生型菌株V592和互补菌株相比,VdOAZ基因敲除突变体的菌落生长速率降低、微菌核产量及产孢量明显减少,对棉花的致病力下降,表明VdOAZ基因与大丽轮枝菌分生孢子和微菌核的产生有关,并参与大丽轮枝菌致病。在VdOAZ基因敲除突变体中,VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2和VdSge1基因表达量显著上调;V592菌株经亚精胺诱导培养后,VdOAZ基因的表达量显著上调,而上述5个致病相关基因的表达量均明显下调,表明VdOAZ基因对其表达具有负调控作用。【结论】VdOAZ基因响应多胺水平改变,通过调控VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2、VdSge1的表达影响大丽轮枝菌孢子产生、微菌核形成和致病过程。     

油菜黑胫病菌T-DNA插入致病力减弱突变体的筛选及侧翼序列分析

为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体。并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,T1、T3、T4、T7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有明显差异,T9、T11与野生型nm-1相比,菌丝形态致密,没有产孢;T1、T3、T4、T7、T9突变体生长速率比野生型nm-1快,而T11显著低于野生型nm-1;6个突变体的产孢能力与野生型nm-1相比都显著下降;Southern Blot分析其T-DNA插入的拷贝数为单拷贝插入。并通过Hi TAIL-PCR技术扩增了6个突变体的右侧翼序列,经Blast比对分析,初步确定了T-DNA插入Leptosphaeria biglobosa基因组的位置,T-DNA插入的右侧翼序列可能为致病基因的部分序列,为进一步确定油菜黑胫病菌致病基因及其功能提供参考依据。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中APSES转录因子FolStuA的功能分析

APSES转录因子保守存在于子囊真菌中,其中Stu A同源蛋白在真菌营养生长,孢子形成和次生代谢过程中发挥着重要的调控作用。由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)引起的番茄枯萎病严重威胁番茄生产尤其是保护地栽培。我们通过基因敲除的方法对尖孢镰刀菌番茄专化型中转录因子Fol Stu A进行功能分析,发现FolSTUA在病原菌的分生孢子阶段表达量最高,而在侵染初期表达量下降。通过对野生型、FolSTUA基因缺失突变体和基因回补菌株进行表型分析,我们发现FolStuA定位于细胞核参与调控病原菌营养生长、小孢子的形成、菌丝融合及致病过程。而在尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxysporum f.sp.melonis)的研究中发现StuA的同源蛋白并不影响小孢子的产量和致病过程。研究结果表明在尖孢镰刀菌不同的寄主专化型菌株中,转录因子StuA的功能存在分化。     

胶孢炭疽菌CgHYD1影响分生孢子的疏水性和对橡胶树的致病性

橡胶树胶孢炭疽菌是橡胶树的重要致病真菌之一。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个候选目的蛋白基因,命名为CgHYD1。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框为294个碱基对,编码一个含有97个氨基酸的蛋白。该蛋白含α螺旋结构和一个Hydrophobin-2疏水蛋白结构域,且该结构域中的第三与第四个半胱氨酸残基之间间隔11个氨基酸,符合Ⅱ类疏水蛋白的结构特征。系统进化树分析结果表明CgHYD1位于Ⅱ类疏水蛋白分支。根据同源重组的原理和真菌原生质体转化方法构建了该基因的敲除突变体ΔCgHYD1以研究该基因的生物学的功能。表型分析结果表明,ΔCgHYD1分生孢子表面的疏水性明显小于野生型,ΔCgHYD1对橡胶树叶片产生的致病性明显比野生型菌株(WT)强。以上结果表明,橡胶树胶孢炭疽菌CgHYD1基因与胶孢炭疽菌分生孢子的疏水性强弱有关,并在炭疽菌致病过程发挥作用。结果为进一步研究CgHYD1在橡胶树致病性与分生孢子疏水性之间的关系提供理论参考,为橡胶树在分子抗病提供理论支持。     

GFP标记的马铃薯大丽轮枝菌生物学特性研究

为了研究马铃薯黄萎病菌的侵染机制,将绿色荧光蛋白基因(GFP)通过农杆菌介导的遗传转化方法转入马铃薯黄萎病菌VD012中,经过潮霉素选择性培养基的筛选和分子鉴定,获得了47株有绿色荧光信号的阳性转化子。随机挑取8株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对转化子的菌落形态、菌丝的生长速率、产孢量、粗毒素含量和致病力进行了研究。结果表明,8株阳性转化子中有3株微菌核产生的数量明显高于野生型,1株转化子微菌核产生量低于野生型菌株;各阳性转化子的生长速率和野生型菌株差异不显著;阳性转化子的产孢量与对照相比,有2株差异不显著。其余均有不同程度的降低。保湿培养8 h,所有阳性转化子的平均萌发率低于野生型菌株。相比对照,粗毒素的含量表现为升高趋势的转化子有7株,1株表现为下降趋势。致病力测定的结果表明,致病力增强的转化子有1株,2株转化子的致病力呈现降低的趋势。     

尖孢镰刀菌古巴专化型FocGDSL1基因功能分析

在尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种基因组中鉴定到一个编码GDSL家族脂肪酶的基因FocGDSL1。序列分析发现该蛋白在镰刀菌属中及其保守。为了研究FocGDSL1的功能和其对尖孢镰刀菌致病力的影响,首先利用同源重组原理构建了该基因的敲除突变体菌株,并进一步对其表型进行了分析。结果发现,FocGDSL1的缺失不影响尖孢镰刀菌的营养生长及其对抑菌药物的抗性;但是FocGDSL1突变株中色素的合成明显减少。与此同时,FocGDSL1突变株对香蕉植株的致病力显著下降。这些结果表明FocGDSL1虽然不是控制尖孢镰刀菌菌丝生长的关键基因,但是FocGDSL1是尖孢镰刀菌重要的致病力因子,可能是尖孢镰刀菌在侵染的前期,分泌FocGDSL1来降解宿主细胞壁和细胞膜,进而使病原菌在宿主体内定殖。     

灰葡萄孢致病力增强突变体BCt98的突变基因分析

为获得灰葡萄孢的致病相关基因并研究其基因功能,筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库,获得了一株致病力增强的突变体BCt98。利用PCR和Southern Blotting技术,对突变体BCt98进行鉴定。利用TAIL-PCR技术结合生物信息学方法,确定了突变体BCt98中T-DNA插入位点位于BC1G_07014.1基因的第3个外显子上。利用RT-PCR技术,确定了突变体BCt98的突变基因为BC1G_07014.1。突变体BCt98生长速度较快,菌落颜色较浅,菌丝较为致密,不产生分生孢子和菌核,且胞壁降解酶(PMG、PG和Cx)及毒素活性较野生型明显增强。表明BC1G_07014.1基因在灰葡萄孢生长、发育和致病力调控方面发挥重要作用,且参与调控病菌的胞壁降解酶活性和毒素活性。     

稻瘟病菌一个假定的漆酶基因功能分析

漆酶可能是病原真菌毒力因子之一。稻瘟病菌基因组共有16个假定的漆酶类基因,对其中的Mgg_00551.5进行了生物信息学和分子遗传学分析,以明确其功能。生物信息学分析表明该漆酶是具有3个多铜氧化酶结构域、可以分泌到胞外的蛋白。经基因敲除表明,Mgg_00551.5功能缺失突变体ΔMG0551-13的漆酶活性比野生型菌株稍低,但是其生长速度、产孢能力、致病性等方面与野生型菌株相比均无明显差异,可能是功能冗余所致。进一步的双突变或多突变可能是明确漆酶功能的重要方法。     

哈茨木霉厚垣孢子产生突变体的筛选及T-DNA标签序列的克隆

利用PD液体培养基从哈茨木霉T-DNA插入突变体库中筛选出在产孢性状上与野生型菌株明显不同突变子7株,其突变表型主要表现在分生孢子产生数量显著减少和菌丝上有大量厚垣孢子分化.利用TAIL-PCR方法对7株突变体的侧翼序列进行克隆,从5个突变体中获取了5条T-DNA侧翼序列.为木霉菌厚垣孢子产生相关全长基因的克隆和产孢机制的研究奠定了基础.     

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。     

稻瘟病菌蛋白激酶MoCbk1的功能研究

真核生物的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞形态建成、胞内信号转导和胚胎发育等过程中,发挥着重要作用,并已经在酵母和一些真菌中得到证实。前期研究发现,在丝状真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中存在一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Kin1,能够调节各种细胞进程,且在许多致病真菌中非常保守。为了更好地研究Kin1蛋白激酶在稻瘟病菌中的功能,我们用生物信息学方法,预测获得了一个与Sc Kin1互作的蛋白Sc Cbk1激酶,在稻瘟病菌数据库中搜索得到了4个与酿酒酵母Cbk1同源性相对较高的蛋白,并与Sc Cbk1和Hs Ndr一起进行了结构域分析,以及常见真菌同源物的系统进化分析。比对结果显示,稻瘟病菌基因MGG_09519和MGG_05376为2个Mo Cbk1。并运用遗传学方法对2个Mo Cbk1进行功能分析。Mo Cbk1a(MGG_09519)基因敲除后,敲除突变体相比野生型菌株和异位整合突变体,生长速率减慢,对水稻大麦等致病力减弱;敲除突变体产孢量略有增加,孢子萌发和附着胞的形成却没有变化。然而,经过多次实验,却无法得到Mo Cbk1b(MGG_05376)的敲除体,敲除体可能是真菌生存所必须的。综上,在稻瘟病菌基因组中,有2个Mo Cbk1基因,它们可能参与稻瘟病菌的营养生长和对水稻的致病过程的调控。     

尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获...     

油菜素内酯提高玉米抗禾谷镰孢菌侵染的生理机制

为明确油菜素内酯(BR)增强玉米抗禾谷镰孢侵染的作用及机制,以玉米郑单958为试验材料,分设喷施BR和未喷施BR的处理,在玉米喷施BR 10 d后,接种禾谷镰孢菌,调查比较喷施BR后玉米感染禾谷镰孢菌的发病情况,确定油菜素内酯提高玉米抗禾谷镰孢侵染的确切作用,结果表明,在未喷施BR的自然生长条件下,在玉米上接种禾谷镰孢,发现茎秆表面有明显的病原菌沿接种针孔侵染扩散的痕迹,玉米茎剖面内髓组织黑褐色严重,几乎整个节间均已被病原菌侵染;但在喷施BR 10 d后再接种禾谷镰孢,玉米茎剖面内的髓组织被病原菌侵染面积明显减少,发病明显减轻,说明BR提高了玉米抗禾谷镰孢侵染的能力。用含BR的PDA培养基培养禾谷镰孢,与对照相比,禾谷镰孢发育未受到明显的影响。BR处理后,玉米叶片脯氨酸含量增加,Real-time PCR分析编码脯氨酸合成酶的基因Zm P5CS的表达量,发现其表达量确实受BR的诱导。同时BR处理后玉米叶片可溶性糖含量极显著增加,保护酶SOD和PAL活性显著增加,POD活性极显著增加。说明BR提高玉米自身抗逆性来提高抵抗禾谷镰孢侵染。油菜素内酯对禾谷镰孢的生长发育没有明显的影响;油菜素内酯提高玉米抗禾谷镰孢侵染的原因可能不是抑制禾谷镰孢的生长发育,而是通过提高玉米脯氨酸合成、保护酶活性、可溶性糖含量,从而提高玉米自身免疫能力。     

中科院揭示禾谷镰孢侵染植物的分子策略

<正>近期,中科院上海生命科学研究院植生生态所研究人员揭示了禾谷镰孢侵染植物的分子策略。禾谷镰孢是一种丝状真菌,能引起小麦赤霉病、玉米茎腐病等多种农作物病害,还能产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇等真菌毒素。禾谷镰孢的基因组编码约14000个基因,已有上百个基因被证明与其致病性相关,但禾谷镰孢致病机制的全貌仍不清楚。     

OsSAMS1在水稻稻瘟病抗性中的功能研究

稻瘟病是水稻最重要的病害之一,对农业生产造成巨大的经济损失。研究表明,水稻中S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶OsSAMS1参与了水稻衰老相关的进程,我们实验室前期利用转录组测序分析发现, OsSAMS1基因的表达水平受稻瘟病菌诱导后明显提高。然而, OsSAMS1是否参与水稻的免疫反应,尚未明确。基于此,本研究选取野生型ZH11为背景材料,通过构建OsSAMS1基因敲除突变体来探究该基因在水稻抗病中的功能。结果表明, OsSAMS1主要在水稻叶片中表达;且其表达明显受稻瘟病菌侵染所诱导。亚细胞定位结果显示,OsSAMS1在细胞膜、细胞质和细胞核内均有表达。通过接种稻瘟病菌发现,与对照相比,2个等位敲除突变体ossams1-1和ossams1-2均表现为更加感病,且体内病程相关基因的表达也明显更低,同时突变体中乙烯合成相关基因的表达也受到明显抑制。综上所述,OsSAMS1参与了水稻的免疫反应,且正调控水稻稻瘟病的抗性。本研究为深入揭示OsSAMS1在稻瘟病免疫反应的分子机理奠定了基础,并为稻瘟病抗病育种研究提供了基因资源。     

高毒力大丽轮枝菌VDG1特异分泌蛋白HSSP致病相关功能分析

以棉花高毒力大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)菌株VDG1和低毒力大丽轮枝菌菌株VDG2基因组测序数据为基础,通过比较基因组学和分泌蛋白预测发现VDG1中1个特异分泌蛋白,将其命名为HSSP。通过PEG介导的原生质体转化方法获得了该基因的敲除突变株ΔHSSP,并以木糖、淀粉、纤维素、果胶、木聚糖和半乳糖为底物模拟分析了其降解细胞壁组分的能力,发现该突变体的果胶酶、木聚糖酶和半乳糖酶活力较野生型显著降低;通过测定菌丝产量和孢子产量,发现HSSP基因对菌丝和孢子的形成均有重要作用;通过定量蘸根接种法在感病棉种军棉1号上测定致病力,发现HSSP基因敲除突变体的致病力与野生型相比明显减弱。上述结果说明HSSP作为高毒力大丽轮枝菌菌株VDG1中1个特异的分泌蛋白在对寄主棉花的致病过程中发挥了重要作用。     

拟南芥茉莉酸信号途径突变体jar1的灰葡萄孢菌抗性分析

为研究拟南芥JAR1 (At2g46370)基因在灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)抗性反应中的作用,从拟南芥生物资源中心获得其功能下降突变体jar1 (SALK_030821)。以纯合突变体为材料,将灰葡萄孢菌的孢子悬浮液接种到4周龄的拟南芥叶片上,统计接种后一周内植株病情指数。通过实时荧光定量RT-PCR测定灰葡萄孢菌肌动蛋白基因(B. cinerea actin)在拟南芥叶片中的表达量,分析了病原物的繁殖情况。结果发现,从接种后的第2天开始,jar1植株的病情指数显著高于野生型。qRT-PCR检测结果表明,在接种后的第三天,野生型植株中B. cinerea actin的表达量是对照的6.9倍,而jar1植株中B. cinerea actin的表达量是对照的20.2倍,说明病原物在jar1突变体叶片上的繁殖速度显著高于在野生型中的。本研究的结果初步表明JAR1基因参与拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性调控。