四种木本油料内参基因筛选及Actin基因时空表达分析

以油茶、沙棘、文冠果和油用牡丹的成熟种子为材料,利用实时荧光定量PCR分析了7个内参候选基因GAPDH、Actin、TUB、eEF1α、RPL4、UBQ和e IF4A在四种木本油料中的表达稳定性,并进一步验证了Actin基因在沙棘不同发育期种子和果肉中的表达。结果表明,6个内参候选基因GAPDH、TUB、eEF1α、RPL4、UBQ和e IF4A的表达水平在四种本油料种子间存在明显差异(p0.05),内参候选Actin基因在四种木本油料种子中的表达较稳定(p0.05)。Actin基因在沙棘种子和果实的不同发育期表达稳定(p=0.380和p=0.603),且在果肉和种子间在各个时期不存在明显差异(p0.05)。这不仅可为沙棘果实不同器官基因表达差异研究提供内参基因,而且可为四种木本油料基因表达研究内参基因的选择提供科学参考。     

建兰花香物质合成相关基因RT-qPCR内参基因筛选

为筛选适用于建兰(Cymbidium ensifolium)花香物质合成相关基因表达分析的内参基因,本研究从建兰‘小桃红’转录组测序结果中筛选出ACT、GAPDH、EF1α、TUA、TUB、CYP、UBQ和ADF这8个常用的内参基因作为候选内参基因。以建兰‘小桃红’的不同花期(小蕾期,中蕾期,大蕾期,初开期,盛花期,衰败期)和盛花期不同花器官(萼片,花瓣,唇瓣,合蕊柱)为实验材料,利用RT-qPCR技术分析候选内参基因在不同样品中的表达量,并结合内参基因稳定性分析软件对候选基因表达稳定性进行分析。结果表明：在候选内参基因中,TUB的稳定性最高,可作为建兰‘小桃红’花香物质合成相关基因表达分析的最适内参基因。     

地黄实时定量PCR内参基因的筛选

本文通过RT-qPCR分析了地黄中7个传统内参基因18S、EF-1?、ACT11、UBQ10、UBQ5、TUB5、GAPDH和4个新报道的内参基因PP2A、RPⅡ、HSP90、TIP41的mRNA表达差异情况,分别利用Ct值比较,GeNorm、NormFiner和BestKeeper软件分析它们在两个发育时期、八种不同组织器官中表达稳定性。结果表明：在地黄花器官中（花瓣、花托、雄蕊、雌蕊、子房）,TIP41和UBQ10表达稳定;在地黄生殖生长期和营养生长期不同器官中（根、茎、叶）,TIP41和UBQ5表达稳定。因此,以上两组基因分别适宜作为不同营养器官的内参基因。     

芍药实时定量PCR内参基因的筛选和验证

以芍药不同花发育时期和不同组织器官为研究材料,利用qPCR技术检测8个内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder,Bestkeeper和RefFinder软件综合评价它们的表达稳定性。结果表明,分析芍药花瓣不同发育时期和不同组织的基因表达时可选用UBQ,GAPDH和ACTIN作为内参基因,而PP2A和SAMS不适于作为内参基因。PlF3H基因的相对表达水平证实,在芍药花瓣不同发育时期,利用UBQ和GAPDH两个表达最稳定的组合即可获得精确的基因表达结果。     

茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选

用CodeHop方法设计简并引物克隆得到了GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、RPL4、eIF4A和eEF1α 7个看家基因的部分序列,将这7个基因和GenBank中已公布的18S rRNA、NADHD 2个基因共9个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析其在茎点枯病菌诱导下芝麻中的表达稳定性。经BestKeeper、NormFinder和GeNorm软件分析可知,UBQ5、eIF4A、α-tubulin 3个基因表达均较稳定,eEF1α变化最大。当使用多基因作为内参基因时,选择这3个最稳定的候选内参基因即可准确矫正定量结果。     

菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR具有灵敏度、特异性和重复性好等优点,是植物中常用于基因表达和转录分析的重要手段。在分子生物学的研究中,选择表达相对稳定的内参基因是分析实时荧光定量实验数据的前提。本研究以菊芋(Helianthus tuberosus)开花时期的幼根、嫩茎、叶片、块茎和花瓣为材料,运用荧光定量PCR方法分析了18S rRNA、EF1α、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ5 7个内参基因的表达量,通过Ge Norm、Norm Finder和Best Kkeeper软件的综合分析,发现25S r RNA的稳定性最好,可用于菊芋基因表达的内参基因。而GAPDH在不同样品中稳定性最差,不适合作为内参基因。本研究为菊芋实时荧光定量PCR中内参基因的选择提供了参考。     

‘紫叶’酢浆草感夜性运动最适内参基因的筛选

‘紫叶’酢浆草(Oxalis triangularis ’Purpurea’)为酢浆草科(Oxalidaceae)酢浆草属(Oxalis)多年生草本植物,除具有极高观赏价值外,也是研究植物感夜性运动的理想材料。为了筛选适合于研究‘紫叶’酢浆草感夜性运动的内参基因,根据白天和夜间状态下叶枕转录组测序结果,选取6个常用内参基因ACT、EF-1α、TUA、TUB、UBC和UBQ作为候选内参基因,以‘紫叶’酢浆草的叶枕、叶柄、小叶和花4个部位白天和晚上的组织为试验材料,通过RT-qPCR对各候选内参基因的表达情况进行检测,利用3个常用内参基因分析软件geNorm、NormFinder和BestKeeper对候选内参基因的稳定性进行评估。结果表明：UBC在3个软件和稳定性综合排名中均在第二,且与各个软件的第一稳定性相近,综合稳定性最高,是研究‘紫叶’酢浆草感夜性运动最适内参基因。同时也为其他‘紫叶’酢浆草基因表达量相关研究提供参考。     

百合体胚诱导、发育及不同组织实时定量PCR内参基因筛选

本研究筛选观赏百合(Lilium oriental×Trumpet hybrid)体胚诱导、发育不同时期及不同组织中稳定表达的内参基因,以观赏百合品种‘Conca D'Or’为研究对象,采用实时荧光PCR分析百合8个候选内参基因(18S,ɑ-TUB,GAPDH,UBQ,b HLH,ACT,EIF,EF1)在体胚诱导不同时期、体胚发育不同阶段及不同组织中的扩增效果,并采用Genorm、Norm Finder和Best Keeper三种软件对候选内参基因在百合中的表达稳定性进行综合评价。结果表明:b HLH在体胚诱导、发育及不同组织中的稳定性优于其他基因;GAPDH及ACT在观赏百合‘Conca D'Or’上扩增效果差。将体胚诱导不同时期、体胚发育不同时期及不同组织的扩增数据放在一起分析,Ge Norm和Norm Finder软件评估最适内参基因为b HLH和EIF,Best Keeper软件评估最适内参为EF1和b HLH。本研究建立了观赏百合实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系并选出观赏百合体胚诱导、发育及不同组织表达最稳定的前三个内参基因分别为b HLH、EIF和EF1。     

沙地云杉种子内参基因的筛选与验证

为筛选出沙地云杉(Picea mongolica)种子成熟过程中均可稳定表达的内参基因,本研究以沙地云杉种子不同发育时期的样本为研究对象,采用RT-qPCR技术,检测沙地云杉种子转录组数据库中GAPDH、EF1α、CYC、Actin等8个候选内参基因在种子发育过程中呈现的综合表达水平,并通过内参基因分析软件(geNorm, NormFinder, BestKeeper)对其稳定性统一评估。结果表明,候选内参基因中稳定性最好的是CYC、EF1α和GAPDH。分别以CYC、EF1α和GAPDH作为内参基因对沙地云杉胚胎发育关键调控基因LEA1(Late embryogenesis abundant protein)和WOX9 (WUSCHEL related homebox)进行了定量分析,其表达趋势基本一致。本研究结果将对沙地云杉及近缘物种的分子育种研究提供参考。     

甜樱桃花芽不同发育时期内参基因的筛选与验证

为了筛选甜樱桃花芽不同发育时期均稳定表达的内参基因,以甜樱桃桑提娜和黔樱一号不同发育时期花芽为材料,通过qRT-PCR技术检测28S rRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18S rRNA、RSP3、CYP40、ACT2和α-TUB3等10个常用看家基因的表达水平,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1a2和RSP3在所有样品中稳定性最好。分别以EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3作为内参基因检测不同发育时期花芽生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式,该2个基因在不同内参基因标定下表达模式相同。表明EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3可作为甜樱桃花芽不同发育时期的内参基因。     

红花檵木实时荧光定量PCR分析内参基因的选择

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是目前基因定量表达分析的重要方法,而适宜内参基因的选择对目的基因表达特征的准确分析至关重要。本研究以红花檵木‘大叶红’（ L. chinense var．Rubrum ‘Dayehong’）的芽、嫩茎、叶、花瓣、种子和愈伤组织为材料,采用qRT-PCR 技术比较了4个常用看家基因微管蛋白基因(α-tubulin)、肌动蛋白基因(β-actin)、18S 核糖体 RNA(18S rRNA)与甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)的表达情况,结果表明：（1）4个看家基因均能特异扩增并显示较高的扩增效率;（2）经 geNorm 和 NormFinder 程序综合分析,当采用qRT-PCR分析红花檵木不同器官和组织中的基因表达差异时,以GAPDH表达最为稳定,可选择作为校正内参基因;在比较不同发育阶段的叶片及明暗处理的愈伤组织中的基因表达差异时,β-actin表达最为稳定,可以选择作为校正内参基因。     

化学药剂处理对蓖麻性别的影响

为明确不同浓度的化学药剂对蓖麻性别的影响,本试验以蓖麻两性系（E09004、E09009和E09002）和E09002单雌系为材料,分析了喷施不同浓度的GA3、NAA、乙烯利、6-BA和AgNO3对蓖麻雌雄花率的影响。结果表明：100 mg/L GA3有利于蓖麻雌花的形成,250 mg/L GA3则有利于雄花的分化,前者表现为雌花率上升,后者表现为雌花率降低;NAA和6-BA使雌花率增加,出现了纯雌株;乙烯利有利于雄花的分化,一定浓度的乙烯利可使两性株雄性化;AgNO3促雄效果明显,使两性株雄花率增加,单雌株出现少量雄花;同时试验还获得少数花性特殊（如全雄、纯雌）的材料。本研究为蓖麻的性别逆转诱导、单雌材料的繁殖及性别分化研究提供参考。     

翼首草实时荧光定量PCR内参基因筛选

本研究以传统藏药翼首草为材料,利用翼首草转录组数据库和RT-qPCR技术分析6个植物常用的候选内参基因(Actin,18S,TUBa,TUBb1,TUBb2和GAPDH)。选用geNorm、NormFider和BestKeeper 3款分析软件进行候选内参基因稳定性分析,以期筛选出翼首草不同组织中表达稳定的内参基因。内参基因Ct值分析、geNorm和NormFider软件分析结果表明Actin基因表达量最高,表达最稳定。BestKeeper软件分析结果表明GAPDH和Actin基因表达最稳定。综合分析结果说明,运用RT-qPCR技术研究翼首草关键基因表达量时,可选用Actin基因作为内参基因。翼首草合适内参基因的确定,可为今后其相关基因表达研究的开展提供依据。     

杜仲雌花芽2个发育时期转录组分析

杜仲(Eucommia ulmoides)的果实是提取杜仲胶和杜仲籽油的重要原材料,在工业、医疗、食品等领域开发前景广阔。为了揭示雌蕊原基发育相关基因的表达情况,本研究以杜仲果用良种‘华仲6号’(Huazhong No.6)为材料,利用lllumina Hiseq X-10高通量测序平台,分别对花序原基分化期和雌蕊原基分化期的花芽进行转录组测序,通过生物信息学对2个发育时期的雌花芽转录组进行比较分析,筛选出与杜仲雌蕊原基发育相关的差异基因。结果显示,转录组测序共获得68.11 Gb数据,各样品的Clean reads与杜仲基因组进行序列比对,比对效率为91.59%~92.05%,同时2个发育时期共筛选出485个差异表达基因,其中219个差异基因在雌蕊原基分化期表达上调,266个表达下调。差异基因GO富集结果表明,花的发育、光周期现象、激素生物合成以及蛋白结合转录因子活性等相关的生物途径被富集。KEGG富集结果表明淀粉和蔗糖代谢、碳代谢、昼夜节律和植物激素信号转导等代谢通路被富集。结果表明光周期途径是诱导杜仲成花的重要途径,且雌蕊原基发育受碳水化合物、植物激素和其他代谢物质调控。本研究为杜仲花器官发育调控基因的挖掘提供了基础数据,也为果用杜仲的分子育种提供了参考。     

休眠期后板栗混合花芽的转录组分析

板栗是中国重要的木本粮食作物,具有极高的经济价值,但板栗雄花比例远远高于雌花,是限制板栗产量的主要因素。为了从分子水平上探讨板栗雌雄花的发生机制,本研究利用高通量测序技术对休眠期后板栗的两种混合花芽的转录组进行比较分析。总计获得了3 772个差异表达基因,其中2 173个基因上调,1 599个基因下调。这些差异基因经过GO分类和KEGG pathway富集分析分别归类于47个GO term和251条代谢途径。从转录组数据中获得了春化、光周期、赤霉素(GA)等途径的开花相关基因,还鉴定多个开花相关内源激素途径的基因。将基因VIN3,GAI,ELF3,GID1的qPCR检测结果与其转录组测序结果进行比对,发现虽然两种检测结果在差异倍数上存在差别,但4个基因的表达量的总体变化趋势一致,说明转录组测序结果有较高的可信性。本研究结果为揭示板栗雌雄花性别比例调控机制和花期人工调控提供了一定的科学参考。     

绵羊Toll样受体家庭在肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激对TLR2、TLR4表达的影响

为确定toll样受体家族在绵羊肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激过程中TLR2、4的动态表达规律.通过RT-PCR方法检测绵羊TLR1-TLR10表达分布;以α-tubulin和GAPDH为内标基因,对绵羊TLR2、4进行克隆和测序,将重组质粒作为标准品建立实时定量PCR标准曲线,通过实时定量PCR方法检测LPS诱导0～48 h TLR2、4的动态表达.结果表明,在绵羊肺泡巨噬细胞中检测到TLR1、2、4、6、7、8、9、10的表达,而TLR3、5未见表达;α-tubulin和GAPDH在LPS诱导前后表达量存在显著差异,均不适合作为内标基因,以使用的细胞数和总RNA量进行均一化校正,发现TLR2、4在诱导后20 min就达到高峰,且在整个诱导过程中维持较高水平.绵羊肺泡巨噬细胞TLR2、4对LPS刺激的应答反应很灵敏,参与机体的早期应答反应.     

基于数字基因表达谱分析的茶树花不育基因挖掘

茶树每年都要开花结实,消耗大量的养分,导致茶树鲜叶产量减少和品质降低。了解茶树的不育机制有助于培育茶树不育品种。本研究以福鼎大白茶(父本)、佛香2号(母本)及其杂交后代(不育)茶树花为材料,利用数字基因表达谱技术对3个茶树花的c DNA文库进行差异基因表达谱分析。筛选出在父本花与子代不育花、母本花与子代不育花之间共有而在父本花与母本花之间没有的差异表达序列1219条,被认为是茶树不育性候选基因。GO功能显著性分析表明,这些基因功能中代谢过程、催化活性、水解酶活性表现为富集;KEGG代谢分析表明,差异表达基因涉及氨基酸、糖、次生代谢、植物信号传导途径以及能量代谢等过程。以植物激素信号转导通路分析发现,16个与生长素信号途径相关基因中,除5个ARF家族基因在子代不育花中上调表达外,其他的基因均下调,推测生长素信号转导是茶树花不育的重要因素。随机抽取5个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致。本研究发现的不育候选基因可用于茶树花不育机制的深入研究和不育基因的筛选。     

木薯内标准基因定性PCR方法分析

内标准基因对于转基因植物及其产品的定性定量PCR检测起着决定性的作用,木薯内标准基因的系统研究是木薯转基因成分检测的基础。在木薯的DFCI（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）数据库中,选择了有可能作为木薯内标基因的一些EST序列,包括亲环蛋白2（cyclophilin type 2,DB934316）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit,TC445）GAPDH、Actin 基因（TC2158与 TC3381的拼接序列）、Alpha-tubulin （TC8072）基因,Polyubiquitin（TC9946）,亚麻苦苷酶 （linamarase,TC1540）六个基因序列,设计了7对定性PCR的引物（CP2、Actin、GAPDH、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）,并进行了种内一致性、稳定性和种间特异性测试分析。结果表明只有木薯的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位的GAPDH定性PCR引物扩增系统在木薯的22个不同品种中都能够得到一致性稳定性的扩增结果,在大戟科其它植物及其它非大戟科植物没有发现非特异性扩增产物。另外六个基因（CP2、Actin、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）的定性PCR引物扩增系统在大戟科其它植物及非大戟科植物中都有非特异性的扩增产物。因此GAPDH定性PCR引物扩增系统初步符合内标准基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,可应用于转基因木薯成分定性PCR检测。