山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养

采用胞质内精子注射（ICSI）构建山羊显微受精胚，在两种培养液（CR1aa和SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液（BFF）和胎牛血清（FBS），研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。结果表明：①在CR1aa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高（22．2％），显著高于添加5％（13．1％）和15％（2．7％）组。②在SOFaa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率（25．1％）显著高于添加5％（12．9％）和15％（3．0％）组。③在两种培养液中，分别添加10％BFF和10％FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22．6％和26．9，5．8％和6．1％。表明：CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜山羊的1CSI胚体外培养；在早期胚胎培养中，添加10％BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率：添加10％BFF比添加10％FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养研究

摘要：为了研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响，分别以0.3% BSA(m/v)、1% PVA(m/v)、1% ITS(v/v)代替成熟培养液中FBS，以添加5% FBS的OM为对照组，对来源于屠宰场的COCs进行体外培养。成熟率PVA添加组（50.00%），显著低于FBS组（83.23%）（P﹤0.01），BSA组（71.19%）和ITS组（76.79%）与FBS组无显著差异（P＞0.05）；成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活，在SOFaa中进行孤雌胚培养，BSA、PVA、ITS及 FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%，囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。实验结果指出:在OM基础培养液中添加BSA或PVA卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS，且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或 P<0.01)；添加ITS，卵母细胞成熟率虽低于对照组，但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近（P>0.05）。结论：以ITS代替FBS，可以用于山羊卵母细胞体外成熟培养。     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养

为研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响,分别以0.3%牛血清蛋白(BSA)(mV)、1%聚乙烯醇(PVA)(mV)和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)(VV)代替成熟培养液中胎牛血清(FBS),以添加5?S的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵巢卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。成熟率PVA添加组(50.00%)显著低于FBS组(83.23%)(P<0.01)、BSA组(71.19%)和ITS组(76.79%),与FBS组无显著差异(P>0.05);成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SOFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或P<0.01);添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近(P>0.05)。表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。     

NCSU23、SOF及氨基酸对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响*

研究了培养基(NCSU23和SOF)和添加氨基酸对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响，以探明猪早期胚胎体外培养的最佳体系。实验结果表明，在高氧(5％CO2的空气)或低氧环境(5％CO2：7％O2：88％N2)中，猪的孤雌发育胚胎培养在添加氨基酸的合成输卵管液(SOFaa)中其囊胚发育率显著低于NCSU23培养液；但培养液中添加氨基酸能显著提高卵裂率，培养后期去除氨基酸可减小氨基酸造成的不良影响。胚胎培养早期(前两天)添加氨基酸，不能提高囊胚发育率和囊胚细胞数。     

牛性控精子体外受精及受精卵的体外培养

为提高牛性别分离精子体外受精的效率,比较精卵共孵育8和22 h受精卵的体外发育能力,使用G- 1/G-2序贯培养液和SOFaa培养液培养牛性控受精卵,筛选出一种适合牛性控胚胎体外培养的培养液.精卵共孵育22和8h,牛性控受精卵的卵裂率分别为(55.9±4.52)％和(50.88±4.44)％,囊胚发育率分别为(35.05±5.02)％和(41.16±5.12)％,差异均不显著(P＞0.05)；精卵共孵育8h组的囊胚孵化率(52.56±6.95)％显著高于22h组(39.81±6.38)％(P＜0.05).用SOFaa和G-1/G-2培养牛性控受精卵,其体外发育率无显著差异.但G-1/G-2液中受精卵发育到第7天时囊胚内细胞数(113.9±9.46)显著高于SOFaa组(102.0±9.97)(P＜0.05).性控精子与卵子共孵育8h可提高牛性控受精卵的囊胚孵化率,G-1/G-2培养液更利于牛性控受精卵的体外培养.     

牛磺酸和颗粒细胞对牛胚胎体外发育的影响

用改良ＣＲ２培养液探讨了牛磺酸（５０μｍｏｌ／Ｌ,１００μｍｏｌ／Ｌ）和颗粒细胞对牛卵母细胞体外受精后的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。试验一中,在培养液中添加牛磺酸（５０μｍｏｌ／Ｌ,１００μｍｏｌ／Ｌ）对牛受精卵的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响（Ｐ＞０．０５）。试验二中,添加颗粒细胞对牛受精卵的分裂率无显著影响（Ｐ＞０．０５）,但促进了牛早期胚胎的囊胚率和囊胚细胞数（Ｐ＜０．０１）;牛磺酸对牛受精卵的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无明显影响。结果表明：在培养液中添加颗粒细胞可以促进牛早期胚胎体外发育的能力;在本试验条件下牛磺酸不能提高牛早期胚胎的体外发育能力。     

无机盐离子对早期牛胚胎在体外发育的影响

本研究系统的探索了培养液中的主要无机盐离子对早期牛胚胎在体外发育的影响。结果表明：培养液中的Ｎａ＋／Ｋ＋比显著影响牛胚胎在体外的发育，提高Ｋ＋浓度有降低囊胚率的作用，最适的Ｎａ＋／Ｋ＋比为１１４／３．２；Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋同样为胚胎发育所必需，其最适浓度分别为２ｍｍｏｌ／Ｌ和０．５ｍｍｏｌ／Ｌ；培养液中添加２．８８ｍｇ／Ｌ的Ｚｎ２＋，其囊胚发育率显著高于空白对照组；培养液中添加０．０２５ｍｇ／Ｌ或０．２５ｍｇ／Ｌ的Ｃｕ２＋完全抑制囊胚发育。这表明Ｚｎ２＋对早期牛胚胎在体外发育有显著的促进作用，Ｃｕ２＋对早期牛胚胎在体外发育有强烈的抑制作用。     

血清添加时间及胚胎培养模式对产业化生产牛胚胎的影响

在利用体外受精技术产业化生产牛胚胎的体系中,体外受精卵一开始就培养在已加入犊牛血清（FBS）的改良SOF液的实验组,其卵裂率（80.6%,253/314）和可冷冻胚胎率（20.8%,129/620）与在体外受精（IVF）3 d后才往胚胎培养体系中加入FBS的结果差异不显著（相应为83.4%,262/314和24.4%,151/620,P〉0.05）;而囊胚率差异显著（分别为41.8%,259/620和 48.5%,301/620,P〈0.05）.在IVF后第3天将培养体系中的未受精卵及发育迟缓的2-细胞阶段胚胎剔除与否的不同胚胎培养模式对其后囊胚的产量和质量均无显著影响.     

受精温度对牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

将经过２０～２４ｈ体外成熟培养后的牛卵母细胞在含５％ＣＯ２，９５％空气，最大相对饱和湿度和温度分别为３７℃（Ｇ１），３８℃（Ｇ２）和３９℃（Ｇ３）的培养条件下进行体外受精，以观察受精温度对牛体外受精及其随后胚胎发育的影响。结果显示，不同受精温度对牛卵母细胞体外精子入卵率（９３．６％～１００％）及受精卵裂率（７８．５％～８０．３％）无明显影响；而早期胚胎卵裂发育速度、体外囊胚发育速度及体外囊胚发育率和孵化率均随着受精温度的升高呈上升趋势。在ＩＶＦ４２～４６ｈ，Ｇ３发育到５细胞以上卵裂周期阶段的早期胚胎比率（４０．３％）非常显著地高于Ｇ２（２４．３％）和Ｇ１（１８．８％，Ｐ＜０．００１）；而相应处于２细胞阶段的胚胎比率（Ｇ３为１４．６％）则十分显著地低于Ｇ２（２５．２％）和Ｇ１（３０．１％，Ｐ＜０．０１）。Ｇ３的囊胚体外孵化率（７５．８％）也非常明显地高于Ｇ２（５１．９％）和Ｇ１（４７．９％，Ｐ＜０．００）。结果表明，受精温度（３７～３９℃）主要影响早期胚胎的质量，从而影响到其随后的囊胚发育率、发育速度及其孵化率，而对卵母细胞的受精、卵裂率无明显影响。     

猪胚胎干细胞培养、分离和传代

摘要:利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料，探索猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)培养、分离、传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件。收集五指山猪第5～10 d胚胎(配种当天记为0 d)，以 STO细胞[STO细胞是来自SIM小鼠(S)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维细胞系]为饲养层，分别采用两种培养液: 杜氏培养液(Dulbecco's modified eagle medium ，DMEM) + 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+ 10 %新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）+1 000 IU/mL白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）+ 30 ng/mL干细胞生长因子（stem cell growth factor , SCF）+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)或DMEM + 10% NBS + 10% FBS + 1 000 IU/mL LIF + 30 ng/mL SCF。比较发现，培养液中是否加入bFGF对胚胎干细胞的培养无显著影响；实验共收集胚胎124枚，其中D5～6胚胎18枚，胚胎贴壁率为68.8% ，内细胞团出现率为6.3% ，未能传代；收集D7孵化囊胚27枚，贴壁率为100% ，内细胞团出现率为38.9% ，传代1次失败；D9胚胎18枚，贴壁率为100%，传代后ES细胞生长较缓慢；收集D10胚胎52枚，胚胎贴壁率为100%，传代率为100%，传代后可出现ES细胞克隆点；实验过程中比较了胚径对干细胞培养的影响，发现胚径越大，培养效果越好，胚径大于100μm,分离ICM后出现干细胞集落成功率达100%，并得到了AP染色呈阳性的传4代的ES细胞集落。     

不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响研究

本试验以昆明系小鼠胚胎为材料，以丝裂霉素（10μg/mL）处理的MEF为饲养层，研究了在ESCs培养液中分别添加KSR、FBS、FBS+PD98059 (50 μmol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM集落形成及ESCs分离培养的影响。结果表明，在添加KSR的ESCs培养液中，胚胎贴壁率显著低于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05），但ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著（P>0.05），2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05），2株ESCs被传到7代；在添加PD98059+FBS的ESCs培养液中，胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1~5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS的ESCs培养液（P＜0.05）；用0.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割，1~5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA（P＜0.05）。结论：在ESCs培养液中添加KSR，较添加FBS或FBS+PD98059更适合用于分离培养昆明系小鼠ESCs，用0.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA。     

牛磺酸、谷酰胺、改良CR1和改良CR2培养液对牛受精卵体外发育的影响

本研究探讨了牛磺酸、谷酰胺、改良CR1 (CR1 无机盐成分 10% 胎牛血清) 和改良CR2 培养液(改良CR1 液 1 m m ol/L谷酰胺和绵羊输卵管分泌液浓度的多种氨基酸)对牛卵子体外受精后的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。结果表明: 牛磺酸和谷酰胺对牛卵子受精后体外发育的影响依赖于胚胎培养液种类; 利用改良CR1 和改良CR2 培养液可成功生产可移植胚胎, 但它们所生产的可移植胚胎的效率无显著差异, 利用改良CR1 培养液生产可移植胚胎的成本更低一些。     

小鼠卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响

本实验通过牛生发泡(GV)期无卵丘细胞卵母细胞-裸卵(denuded oocytes,DOs)与小鼠卵丘细胞(mouse cumulus cells,mCCs)共培养,研究异种mCCs对牛DOs体外成熟和孤雌激活后发育的影响,进而探讨卵丘细胞对卵母细胞的作用机制,为牛卵母细胞体外成熟效率提高提供实验依据.牛卵母细胞分为COCs(cumulus-oocytes complexes)组、DOs+bCCs(bovine cumulus cells,bCCs)组、DOs+mCCs组和DOs组4个组合,体外成熟22～24h后,检测各组卵母细胞第一极体排出率、MⅡ期卯母细胞中谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量利孤雌激活后的发育能力,以及卵母细胞内骨形态发生蛋白15( BMP15和生长分化因子9(GDF9)mRNA相对表达水平.结果表明:(1) DOs+mCCs组和DOs+bCCs组卵母细胞核成熟率[(68.48±5.71)％,(71.00±4.27)％]显著低于COCs组(84.70±3.41)％(P＜0.05),但均显著高丁DOs组(54.26±5.03)％(P＜0.05); (2) DOs+mCCs组MⅡ卵母细胞GSH含量和孤雌激活囊胚率[(2.48±0.24) pmol/oocyte,(44.19±4.03)％]与DOs+bCCs组[(2.49±0.18)pmol/oocyte,(48.57±5.20)％]和DOs组[(2.40±0.17)pmol/oocyte,(43.47±7.34)％]之间没有差异,但分别显著低于COCs组[(9.67 ±0.18)pmol/oocyte,(59.93±6.13)％](P＜0.05),各组孤雌激活卵裂率之间没有显著差异[(98.85±4.32)％,(92.11±2.00)％,(95.40±4.11)％,(93.18±3.19)％](P＞0.05);(3)DOs+mCCs组、DOs+bCCs组和COCs组卵母细胞中BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平均显著性高于DOs组(P＜0.05),其中,DOs+mCCs组和COCs组GDF9 mRNA相对表达水平显著高于DOs+bCCs组(P＜0.05).实验结果表明,mCCs能提高牛DOs的核成熟率及BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平,但对牛DOs的细胞质成熟和MⅡ卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚发育没有促进作用,说明卵丘细胞通过一些旁分泌因子促进卵母细胞核成熟,且这些因子的作用可能没有种属特异性.     

水牛体细胞核移植相关影响因素的研究

主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin,APD）培养处理24h,再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05）,但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％,P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁,另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05）,但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％,P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％,P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率;（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞,而且以雌性的效果较好。     

鸡胚原始生殖细胞的分离、培养及鉴定

采用Ficoll密度梯度离心法分离第19期(孵化68～72 h)艾维茵鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGC)，通过体细胞-PGC共培养进行了原代和传代培养，对PGC进行了碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAS)鉴定，并用细胞增殖核抗原(PCNA)免疫细胞化学检测了传代于鸡胚饲养层上PGC的增殖活性。培养的PGC经AKP和PAS鉴定均为阳性，AKP阳性为红棕色，PAS阳性为深红色，PCNA染色显示PGC集落为红棕色，表明PGC处于增殖状态。同时比较了不同体外培养条件(5%~20%胎牛血清(FCS), ITS培养液(M199+ 10 μg/mL 胰岛素+5 μg/mL转铁蛋白+3×10-8 mol/L亚硒酸钠), 条件培养液, 15%FCS+ITS, 15%FCS+40% 条件培养液)下PGC增殖情况。发现未经密度梯度离心的PGC生长较离心的PGC好，且5%FCS在原代培养中起较好的促增殖作用；而传代培养时在不同培养条件下，5%FCS组或ITS组形成的PGC集落的直径较大，而仅用单纯的条件培养液效果并不明显。结果表明除鸡胚饲养层可作为PGC增殖的支持体系外，在体细胞-PGC共培养方式下5%FCS或单独的ITS也可作为PGC体外增殖的一种培养体系。