西瓜ClP5CS基因克隆及其功能研究

【目的】克隆西瓜自交系M08的ClP5CS基因(Cla006553和Cla017928)cDNA序列全长,探究其在抵御干旱和盐胁迫中的作用。【方法】利用西瓜基因组信息,以M80幼叶为材料,克隆Cla006553和Cla017928的编码序列,对其氨基酸序列进行生物信息学分析和同源分析;构建这2个基因的过表达载体转化农杆菌,采用浸花法浸染拟南芥,选取相应转基因T2拟南芥株系,检测其在脱落酸(ABA)、甘露醇、NaCl及干旱胁迫下的发芽率、根长、成活率及脯氨酸含量,研究Cla006553和Cla017928对拟南芥抗逆性的影响。【结果】Cla006553编码序列长2 166bp,编码721个氨基酸;Cla017928编码序列长2 145bp,编码714个氨基酸。Cla006553与Cla017928的核苷酸和氨基酸序列之间的相似性为分别为74.19%和77.12%,其氨基酸序列中含有ATP结合位点、脯氨酸反馈抑制位点、亮氨酸拉链、谷氨酰激酶结构域、NAD(P)H结合位点、亮氨酸结构域、谷氨酸半醛脱氢酶结构域。转Cla006553和Cla017928基因的拟南芥植株在ABA、甘露醇、NaCl和干旱胁迫下的发芽率、根长、脯氨酸含量、成活率等均高于对照,具有较好的耐旱和耐盐能力。【结论】克隆了西瓜P5CS的2个编码基因Cla006553和Cla017928,这2个基因均可增强转基因拟南芥植株的抗逆能力。     

西瓜葫芦素E变化规律及其相关基因关联分析

为探明西瓜（Citrullus lanatus）不同发育时期果实中葫芦素E积累机制，通过高效液相色谱法测定西瓜不同发育时期果实、叶片和茎蔓中葫芦素E含量，在葫芦科数据库中鉴定西瓜葫芦素E合成代谢关键基因，结合前期构建的转录组数据挖掘葫芦素E代谢相关关键基因，共筛选得到9个参与葫芦素E生物合成的候选基因，与其他葫芦科作物同源基因作同源性比对及系统进化树构建，初步推测细胞色素P450酶基因家族、氧化角鲨烯环化酶（OSC）基因、转录因子ClBt基因和乙酰转移酶（ACT）基因上调表达与西瓜果实中葫芦素E积累相关，Cla007078、ACT和OSC基因为西瓜葫芦素E合成代谢相关候选基因。研究为进一步探究西瓜葫芦素E积累相关基因功能提供参考。     

芥蓝(Brassica alboglabra)苯丙氨酸解氨酶基因BaPAL的克隆、表达与序列分析

根据NCBI数据库中拟南芥、甘蓝型油菜和菘蓝的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)基因序列设计简并引物,从芥蓝叶片cDNA中克隆到1个PAL基因,定名为BaPAL.BaPAL编码区全长2 145 bp,编码714个氨基酸,在NCBI的登录号为FJ849059.半定量RT-PCR结果表明,BaPAL基因在茎、叶、花蕾、开放花朵和嫩角果中均有表达,而且以开放花朵的表达量最大,根中未能检测到.BaPAL与其他植物PAL序列比对的结果表明:芥蓝与甘蓝型油菜、白菜的关系最为接近,与同科的菘蓝和拟南芥的关系稍远,但它们都处于同一进化分支;跟蕨类植物的同源性最低,亲缘关系最远.     

番茄与西瓜中番茄红素生物合成途径基因的比较分析

为了阐明番茄和西瓜中番茄红素生物合成途径的相关基因,借助比较基因组学,在全基因组水平上对两物种间该代谢途径进行了比较分析。在番茄中共鉴定了12个番茄红素生物合成途径基因,在西瓜中发现了14个相应的番茄红素生物合成途径基因,同时将所有基因定位到相应的染色体上。番茄和西瓜中直系同源番茄红素生物合成基因在核酸水平保持在54.8%~75.0%的一致性,而西瓜中相应的旁系同源基因在核酸水平上的一致性为70.5%~74.8%。番茄与西瓜中番茄红素直系同源基因间在基因结构上高度相似。且系统进化分析发现西瓜中番茄红素生物合成关键基因PSY(Cla005425)和LCYE(Cla016840)可能与胡萝卜中的直系同源基因拥有共同的祖先。     

紫苏迷迭香酸合成酶基因片段克隆及表达

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是迷迭香酸生物合成途径中催化合成迷迭香酸重要前体物质2-氧-(4-香豆酰)-3-(4-羟基苯)乳酸的关键酶.利用同源序列扩增方法成功获得了紫苏RAS基因cDNA片段,命名为PerRA S-1,该片段长353 bp,编码117个氨基酸(GenBank登录号:JQ824060.1).通过氨基酸序列比对分析,发现其氨基酸序列与香蜂草、彩叶草和丹参RAS基因片段的相似度分别高达86.44％,83.05％和83.05％.RAS系统进化树分析表明PerRAS-1与唇形科植物的RAS亲缘关系较近.荧光实时定量PCR对目的基因的表达谱分析表明,PerRAS-1基因在紫苏根、茎和叶中均有表达,且在根中表达量最高.紫外线(UV-B)照射和过氧化氢(H2O2)处理紫苏叶片在一定程度上下调PerRAS-1基因在叶中的转录水平;茉莉酸甲酯(MeJA)在一定程度上上调PerRA S-1基因在叶中的转录水平.     

红花檵木LcCHI基因的克隆、表达分析及转化研究

从红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)叶片中克隆获得查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)同源基因,命名为LcCHI。LcCHI基因的开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸。氨基酸序列同源性比对结果表明,红花檵木LcCHI与包括玫瑰(Rosa rugosa)、月季(Rosa chinensis)在内的多种植物CHI的氨基酸序列同源性很高,氨基酸一致性均在75%以上。CHI负责酶催化活性的5个氨基酸残基位点也在不同植物的CHI氨基酸序列中高度保守。LcCHI蛋白的三级结构主要由8个α-螺旋和11个β-折叠片层形成的球状蛋白,其催化核心区域具有两个硝酸根配基结合位点。实时荧光定量PCR结果表明,LcCHI在不同组织中均有表达,其中在根中表达量最高,而成熟叶中表达量最低。成功构建了pLcCHI-SUPER1300过表达载体,在拟南芥中异源表达并获得了LcCHI基因过表达的转基因株系,为进一步分析LcCHI基因功能创造条件。     

紫苏4-羟苯基丙酮酸双加氧酶基因 片段的克隆及表达分析

为获得紫苏迷迭香酸合成途径旁路中的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）基因,采用同源克隆的方法, 根据已报道的其他植物的HPPD 基因序列设计合成简并引物,克隆得到紫苏HPPD 基因片段,命名为PerHPPD-1, 该片段长663 bp,编码221 个氨基酸。通过氨基酸比对分析发现,其氨基酸序列与丹参和彩叶草的HPPD 基因片段 一致性分别为66.36%和77.93%,系统进化树分析又进一步表明该片段与唇形科植物的亲缘关系最近。荧光实时定 量PCR 检测结果显示,PerHPPD-1 基因在紫苏根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高,其次为茎、根。激素（赤霉 素、茉莉酸甲酯、脱落酸）处理可在一定程度上上调PerHPPD-1 在叶中的表达水平。     

油菜N13和N18上含油量QTL作图区间相关候选基因克隆

以前人报道的SG-图谱和DH群体为材料,利用拟南芥脂质基因库和芸薹属EST库信息资源,选择与拟南芥中诠释的重要油脂合成相关基因高度同源的甘蓝型油菜EST和其他具有基因信息的EST序列为标记来源,发展功能基因标记加密SG图谱;对定位在N13和N18连锁群上含油量QTL区间的相关基因片段进行克隆、测序和生物信息学分析,以期获得可能与种子含油量QTL有关联的侯选基因。结果表明:在2条连锁群的3个含油量QTL区域内共连锁上6个功能基因,其中与拟南芥同源的3个基因在油脂合成途径中发挥重要作用;其双亲差异片段经克隆测序和比对分析,发现有2个在双亲间存在氨基酸水平差异;将获得的基因片段和拟南芥同源基因序列比对结果显示,二者间内含子部分核苷酸序列相似率平均为57.7%,外显子区域为86.7%,氨基酸水平上则达到89.2%。     

茎瘤芥BjPKS1 基因的克隆及遗传转化

茎瘤芥(榨菜)具有瘤茎膨大的性状,该特征是一种重要的经济性状。在前期研究中,我们获得一个可能与瘤茎膨大有关的基因片段,该基因与拟南芥PKS1基因相似。通过RACE技术获得了该基因全长序列,命名为BjPKS1。该基因的mRNA序列全长1440bp,其预测的ORF长度为1131bp,编码的氨基酸序列长度为376aa。多序列比对发现,预测的氨基酸序列与其他物种的PKS基因家族蛋白具有高度相似性,在多个区域都高度保守,进化分析显示Bj PKS与拟南芥的PKS1基因关系最近。荧光定量RT-PCR结果显示,该基因在茎瘤芥瘤茎膨大发育的过程中表达量明显上升。将该基因转化拟南芥,转基因植株株高和节间都明显缩短。结果表明BjPKS1可能具有其他物种中同源基因相似的分子功能,其在茎瘤芥瘤茎膨大过程中的作用有待进一步研究。     

番茄与西瓜中番茄红素生物合成途径基因的比较分析

为了阐明番茄和西瓜中番茄红素生物合成途径的相关基因,借助比较基因组学,在全基因组水平上对两物种间该代谢途径进行了比较分析。在番茄中共鉴定了12个番茄红素生物合成途径基因,在西瓜中发现了14个相应的番茄红素生物合成途径基因,同时将所有基因定位到相应的染色体上。番茄和西瓜中直系同源番茄红素生物合成基因在核酸水平保持在54.8%⁷5.0%的一致性,而西瓜中相应的旁系同源基因在核酸水平上的一致性为70.5%75.0%的一致性,而西瓜中相应的旁系同源基因在核酸水平上的一致性为70.5%⁷4.8%。番茄与西瓜中番茄红素直系同源基因间在基因结构上高度相似。且系统进化分析发现西瓜中番茄红素生物合成关键基因PSY(Cla005425)和LCYE(Cla016840)可能与胡萝卜中的直系同源基因拥有共同的祖先。