J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM-IMC2.2重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10200gp85基因，构建了转移栽体pFast Bacl-IM gp85，并利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-IMC gp85。转染Sf9细胞后的表达研究表明，重组杆状病毒可高效表达IMC10200的gp85基因，表达产物具有病毒的抗原特异性，与ALV-J单抗JE9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明，表达产物的分子质量约54ku。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT-PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindⅢ,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18-T-Hrb-1/env,对其进行Pst Ⅰ酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb-1 gp85基因的997bp片段,应用Bac to Bac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFast Bac HTA进行连接,获得重组载体pFAST BacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础.     

J-亚群禽白血病JL-2株的分离鉴定

近年来，J-亚群禽自血病的暴发流行在国内时有报道，在本研究中，自吉林某患病鸡群分离出一株病毒，采用特异性引物，经RT-PCR扩增出长度为545bp的J-亚群禽自血病病毒特异性核苷酸片段；将病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖，获取其前病毒DNA，依据原型毒株RPRS-103 cDNA序列设计并合成一对引物，经PCR扩增得到包括gp85、gp37、E-element基因在内的近1．8kb的DNA片段，将其连到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌JM109，培养后提取质粒分别用Hind Ⅲ，BamHI进行单酶切和双酶切鉴定，得到了阳性重组质粒pMD18-T-JL2／env，核苷酸序列测定结果表明，该片段为J-亚群禽白血病病毒囊膜基因，其中亚型特异性片段gp85和标准对照毒株HPRS-103的同源率为94％，所编码氨基酸的同源率为87％。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

K亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

研究分别将K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的gp85基因以及env基因分别克隆到原核表达载体pColdⅠ以及真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后分别命名为pCold-K-gp85以及pcDNA3.1-K-env。pCold-K-gp85转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现,该Gp85重组蛋白主要表达在包涵体中。利用纯化后Gp85重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了抗ALV-KGp85蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光以及Westernblot试验进一步证明,所获得的抗Gp85蛋白的多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-K-env质粒以及感染ALV-K的DF-1细胞内表达的Env蛋白。以上研究结果为进一步探究ALV-K宿主范围,细胞受体鉴定及亚群特异性诊断技术研究奠定了基础。     

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于J亚群禽白血病病毒（ALV-J）原型株HPRS-103基因组碱基#5394-#5416及#7811-#7794的1对引物对PCR，在2000-2001年从山东，河南和宁夏分离的8株ALV-J中，有6株可以扩增出含gp85基因的2.2kb左右的特异性片段，对其中5株的扩增片段做了序列分析，结果表明，这5个毒株的囊膜糖蛋白gp85与原型株hprs-103有93.4%-96.8%的同源性，与我国最早的分离株SD99024有93.7%-98.7%的同源性，它们相互之间的同源性为91.2%-98.7%，由此说明，我国AVL-J的gp85基因正在不断发生变异。     

禽白血病病毒囊膜基因gp85片段的克隆与鉴定

用ＰＣＲ从禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV)RAV-1,RAV-2感染或未感染的ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）分别扩增出１．２kb囊膜基因片段，分别将上述ＰＣＲ产物的KpnⅠ／SaⅡ酶切片段克隆到质粒pGEM-3zf( )中得到３个重组子即pGEM-3zf-RAV-1env、pGEM-3zf-RAV-2env和pGEM-3zf-Eenv。酶切分析和序列测定结果表明克隆的ＰＣＲ片段分别来自ＡＬＶ ＲＡＶ－１，ＲＡＶ－２和内源生Ｅ亚群病毒，这为病毒囊膜基因gp85的表达及个体鸡遗传抗性的鉴定打下基础。     

J亚群禽白血病病毒中国分离毒SD9902株env-gp85基因的克隆及表达

将 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)急性转化型中国分离毒 SD990 2株的 env- gp85基因的 PCR产物克隆进表达性载体 p GEX- 5 X- 3中 ,构建成重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85。将重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85转化的 BL 2 1大肠杆菌培养并用 IPTG诱导后 ,其菌体的超声波裂解物用 SDS- PAGE电泳分离蛋白质 ,在经考马斯亮蓝染色的 SDS- PAGE凝胶中与非重组载体 p GEX- 5 X- 3的转化菌裂解物相比 ,重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85的转化菌失去了相对分子质量为2 90 0 0的天然谷胱甘肽 (GST)蛋白带 ,但出现 1条相对分子质量为 6 30 0 0的条带 (相当于 AL V- J囊膜 gp85蛋白与GST的融合蛋白的相对分子质量 )。在 Western- blot中 ,AL V- J特异性单抗 JE9仅能从重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85的转化菌中特异性地识别出该 6 30 0 0的蛋白条带 ,而与天然非重组载体 p GEX- 5 X- 3的转化菌不发生反应。而抗 GST的抗体却从天然非重组载体 p GEX- 5 X- 3和重组质粒 p GEX- SD990 2 - gp85的转化菌中分别识别出 2 90 0 0或 6 30 0 0的条带。 Western- blot的结果证明 ,能分别被 AL V- J特异性单抗 JE9及 GST特异性抗体识别的相对分子质量为 6 30 0 0的蛋白质 ,确实为 GST与 AL V- Jgp85蛋白的融合蛋白     

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941 bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52 ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×10⁵。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。     

禽白血病病毒gp85蛋白在293T细胞中的表达及分析

为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。     

血管瘤相关J亚群禽白血病病毒ZH-08株的分离与全基因组序列测定

本研究从临床表现为典型血管瘤型禽白血病病例的广东某肉种鸡场的病鸡中,分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为ZH-08。利用ELISA抗原检测、PCR和间接免疫荧光试验对分离株进行鉴定,结果都呈阳性。依据ALV-J原型株HPRS-103前病毒全基因组序列设计并合成3对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示该分离株基因组序列全长7 597 bp,与已公开的全基因组序列大小比较略有差异,但符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp85基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较,发现ZH-08与YZ9901株相似性最高(93.7%)。基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明:ZH-08株与SD07LK1株的亲缘关系最近。本研究为该毒株的生物学特性以及致病机制研究奠定了基础。     

七彩山鸡F亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

为了解广东某七彩山鸡种禽场禽白血病流行情况,通过接种DF-1细胞、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)、囊膜基因克隆测序等方法分离并鉴定出两株ALV-F,分别命名为FGD1801和FGD1802。为进一步了解分离株遗传进化特点,利用PCR方法扩增出env基因并测序,同时与各亚群参考毒株的gp85核苷酸序列进行对比。结果显示:这两个分离株env基因gp85片段长度都为1080 bp,预计编码360个氨基酸,FGD1801和FGD1802分离株gp85基因核苷酸序列的相似性为92.8%,与A、B、E、J和K亚群共26株ALV参考毒株相似性在47.0%~64.5%之间,而与F亚群参考株的相似性在92.0%~92.5%,显著高于其他亚群,且位于同一进化分支上。研究表明,从七彩山鸡分离的FGD1801和FGD1802属于ALV-F,是我国华南地区新发现的ALV亚群。     

用ALV-J gp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法,对病理学初步诊断为蛋用型鸡J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经,用特异性抗J亚群禽白血病病毒(ALV—J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测,待检的组织切片中均检出阳性抗原,免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡J亚群禽白血病的自然病例。     

J亚群白血病的病理学观察及基因分析

内蒙古某肉种鸡场40周龄种鸡发生肿瘤性疾病，死淘率15％；经病理组织学检查，增生的肿瘤为典型的髓细胞瘤，因此怀疑此病是J亚群白血病。取病鸡肝电镜观察，在肝细胞胞浆膜下见有圆形的类病毒粒子存在；将肝病料处理后接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)，经电镜观察，可见正出芽的病毒粒子。为进一步确诊，以ALV-J原型株HPRS-103囊膜gp85基因为基础设计特异性引物，以感染的CEF基因组DNA为模板，体外扩增(PCR)gp85基因，结果获得了924bp的相应片段。将PCR产物进行分子克隆和序列测定，结果表明，内蒙古地区ALV-Jgp85蛋白的推测氨基酸与ALV-J原型株HPRS-103、山东SD9901株、美国ADOL-R5-4株及内源性病毒EAV-HP的gp85蛋白的氨基酸同源性分别为97.40％、95.13％、86.69％和85.06％，其中与HPRS-103的同源性最高，与EAV-HP同源性最低。因此可以确定本研究所克隆的基因为ALV-Jgp85基因，暂命名为ALV-J-NM8761。     

我国部分地区蛋鸡ALV-J分离株gp85基因遗传进化分析

为了解我国蛋鸡J亚型白血病病毒(ALV-J)株来源及其遗传进化关系,本研究对2009年从我国6个省区蛋鸡场分离到的19株ALV-J的gp85基因进行克隆和测序,并与11个ALV-J参考株gp85基因作了比较分析.结果表明:19个ALV-J分离株的gp85基因长度为894bp～924 bp不等,分别编码298～308个氨基酸;各病毒株间gp85推导氨基酸的同源性为71.3%～100%.遗传进化分析表明,目前我国蛋鸡ALV-J分离株来源复杂,其中13个分离株与英国原型株HPRS-103、国内麻黄肉鸡株SCAU-0901亲缘关系较近;3个分离株与美国株ADOL-7501及国内白羽肉鸡株HN0001处在同一大的分支;而另外3个分离株则各自形成独立的分支,表明其gp85基因发生了较大变异.本研究表明,19个分离株与国内早期肉鸡分离株亲缘关系较远,提示我国当前蛋鸡ALV-J株可能并非源自国内早期肉鸡ALV-J株,其来源有待进一步研究.