蜜蜂(Apis mellfiera)腺苷酸转移载体基因cDNA的电子克隆

以果蝇腺苷酸转移载体基因cDNA序列为信息探针,对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选,克隆了蜜蜂腺苷酸转移载体基因(Am ant)的cDNA序列(GenBank登记号为AY332626),该基因全长1 251bp.经RT-PCR克隆、序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为300个氨基酸,通过对人、果蝇、家蚕及烟草天蛾的腺苷酸转移载体蛋白序列比较,发现该基因具有高度的保守性;说明根据物种间同源基因序列,进行跨物种EST数据库的同源检索筛选、拼接,是基因克隆的一条有效途径.     

蜜蜂磷酸丙糖异构酶基因(AmTpi)全长cDNA的电子克隆及其验证

用电子克隆的方法获得蜜蜂(Apis mellifera)磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphate isomerase,Tpi),对该基因序列进行克隆及生物信息学分析.结果表明,该基因全长1768 bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),编码247个氨基酸的蛋白;其编码的氨基酸序列与果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyxmori)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、按蚊(Anopheles gambiae)、烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)的磷酸丙糖异构酶的蛋白序列具有较高的保守性.     

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。     

马尾松毛虫腺苷酸转移酶基因的克隆与分析

 【目的】克隆马尾松毛虫腺苷酸转移酶基因。【方法】采用RACE方法克隆基因,利用软件分析推导蛋白的保守结构域,并与已报道的其它8种昆虫腺苷酸转移酶进行比较,并构建系统树,用southern法分析该基因在单倍体基因组中的拷贝数。【结果】获得马尾松毛虫腺苷酸转移酶基因全长cDNA（GenBank登录号：EF194157）,该基因无内含子,在烟草天蛾(M. sexta)、棉铃虫（H. armigera）、家蚕（B. mori）蜜蜂(A. mellifera)、绿蝇( L. cuprina)、果蝇(D. melanogaster )、蚊子(A. gambiae) 等昆虫间高度保守。基因组酶切后呈单一Southern杂交带。【结论】马尾松毛虫松毛虫腺苷酸转移酶基因高度保守,在基因组中单拷贝存在。     

棉花TRY基因的电子克隆

[目的]克隆棉花TRIPTYCHON(TRY)基因.[方法]利用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,克隆棉花TRY基因,并利用生物信息学分析软件,分析棉花TRY蛋白的生物信息.[结果]从徐州142无绒无絮突变体中,克隆到棉花TRY基因,其ORF(Open reading frame )全长270 bp,编码89个氨基酸.棉花TRY蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,不存在信号肽及糖基化位点,没有跨膜结构,定位于细胞核,三级结构不存在卷曲螺旋结构.[结论]在棉花中利用电子克隆技术克隆TRY基因是可行的,同时研究结果为进一步研究棉花TRY基因的功能和棉纤维发育调控机制提供理论依据.     

猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/ Swine/ Inner Mongolia/ 547/ 01 (H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD 18-T载体.重组pMD 18-T经Sal I 和 EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的Sal I/EcoRI位点.PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体.这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础.     

西方蜜蜂(Apis mellifera)不同蜂种及其杂交组合采粉力研究

“浙农大 1号”意蜂 (A .m .ligusticaEa)分别与喀尼鄂拉蜂 (A .m .carnica)、卡尔巴阡蜂 (A .m .carpati ca)、高加索蜂 (A .m .caucasica)、乌克兰蜂 (A .m .acervorum)、东北黑蜂 (A .m .spp .)进行正反杂交组配。在山东玉米花期 ,考察这 6个西方蜜蜂蜂种及 10个正反杂交组合的 95个试验蜂群的蜂花粉生产性能 ,分析杂交一代的杂种优势。结果表明 ,K是 6个纯种中蜂花粉产量最高的蜂种 ,Ea位居第二 ,Ea×D是所有纯种和杂交组合中蜂花粉产量最高的蜂种 ,是培育蜂花粉高产组合的蜂种。杂交组合Ea×D和W×Ea的蜂花粉生产性能具有明显的杂种优势 ,其杂种优势率分别达到 49.5 %和 2 1.1%,其他 8个杂交组合表现为杂种劣势     

西方蜜蜂（Apis mellifera L.）sRNA的富集与文库检测

 【目的】提取及扩增蜜蜂（Apis mellifera L）sRNA,并构建文库检测富集结果是否满足高通量测序研究要求。【方法】取蜜蜂3个级型不同发育阶段个体作为材料,分别提取总RNA后混合,从中分离出15～40nt的sRNA,反转成cDNA后构建文库,进行蓝白斑筛选。挑选288个单克隆进行测序,对测序结果进行分析。【结果】有效序列为214条,插入的cDNA片段大小范围为15～39 bp。其中,sme-miR-71c miRNA 65条,ncRNA（包括tm-RNA、intron_ghI、5.8s rRNA）5条,tRNA 28条,siRNA及其他sRNA 33条, CDS 1条,未知序列82条。【结论】本实验采用的方法能有效富集蜜蜂sRNA,能够满足高通量测序从中识别出蜜蜂miRNA的研究。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

蜜蜂(Apis mellifera)毒的柱层析分离及其主要组份Melittin的抗凝作用

 蜜蜂(Apis mellifera)毒通过葡聚糖凝胶G50分离为七个组份,并进行了酶活力测定和毒性测定,酶测定作了磷酯酶A₂,水解蛋白酶,三磷酸腺甙酶,一磷酸腺甙酶等。对直接溶血组份在血液凝固系统上的作用进行了体内外实验,实验表明:抗血凝固作用是由于抑制了凝血活酶的生成和凝血酶原激活物的生成。     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测(英文)

[目的]克隆蜜蜂(Apis mellifera)TPI基因,并进行生物信息学预测。[方法]利用电子克隆方法获得蜜蜂磷酸甘油醛异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白的等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测。[结果]蜜蜂TPI基因全长为1768bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),所编码蛋白的等电点为8.515。二级结构预测表明TPI蛋白属于α/β蛋白。[结论]利用蜜蜂表达序列标签数据库(EST)电子克隆蜜蜂新基因的研究工作有一定的现实意义,为进一步在分子水平研究蜜蜂提供更多的参考。     

日本百脉根■牛儿基■牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牛儿基牛儿基氢化酶(GGH)基因cDNA序列为信息探针,搜索GenBank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1 389 bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架(ORF),推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牛儿基牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91%、89%、84%、81%7、3%、74%。该基因与叶绿素等的生物合成有关。     

日本百脉根牻牛儿基牻牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牻牛儿基牻牛儿基氯化酶（GGH）基因cDNA序列为信息探针,搜索GenRank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1389bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架（ORF）,推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牻牛儿基牻牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91％、89％、84％、81％、73％、74％。访基因与叶绿素等的生物合成有关。     

棉花乙烯受体基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]电子克隆并分析棉花乙烯受体基因（Ethylene Receptor,ETR）。[方法]利用生物信息学方法,以毛果杨的ETR基因家族序列为基础,电子克隆棉花乙烯受体基因开放阅读框,并对序列进行氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、信号肽及系统进化等预测分析。[结果]通过电子拼接,共获得该基因家族的2个棉花ETR基因GhETR1和GhETR2。2个基因开放阅读框长度分别为2 289 bp和2 226 bp,编码含762和741个氨基酸残基的肽链。经生物信息学分析发现,两基因分属于ETR2和ETR1亚家族。N端有典型的跨膜区,含有ETR蛋白的保守域GAF、H isKA、HATPase-c和REC。GhETR1与毛果杨XP_002315717、XP_002311669相似性较高,GhETR2与毛果杨XP_002299688、XP_002327419相似性较高。[结论]该研究结果为进一步研究棉花GhETR基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

In Silico Cloning and Sequence Analysis of Phospholipase Dα Gene from Peach Fruit

Phospholipase D （PLD, EC 3.1.4.4） plays an important role in adaptive response of postharvest fruit to environment. In this study, a novel cDNA of PLDα was isolated with the strategy of in silico cloning in combination with RT-PCR from peach （Prunus persica L. cv. Jiubao）. The obtained PLDα gene contained a complete open reading frame encoding a 92- kDa protein of 810 amino acid residues, which possessed the characteristic C2 domain and two catalytic HKD motifs. The alignment analysis of the deduced peach PLDa protein with other known PLDα family proteins indicated that peach PLDα was conserved and highly homologous with strawberry PLDα. Semi-quantitative RT-PCR and Northern blot analysis indicated PLDα mRNA in peach fruits could be induced by low temperature. This work provided a scientific basis for further investigating the mechanism of postharvest fruit adaptation to low temperature.     

甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆及其功能预测

［目的］对甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行克隆及功能预测。［方法］采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法首次从甜杨中分离了G6PDH基因,通过Blast和其他生物信息学软件进行功能预测。［结果］甜杨G6PDH基因的cDNA长1697bp,可编码510个氨基酸,cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与其他植物G6PDH存在着较高的同源性,说明所获得的cDNA是甜杨G6PDH基因（PsG6PDH,AY445917）。同时,运用PCR扩增技术获得了甜杨G6PDH基因组序列,测序结果表明,基因组DNA长度为5 040bp,含有15个外显子和14个内含子。Southern杂交结果表明,G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。通过网络服务器平台进行PsG6DH的功能预测,结果显示,PsG6PDH为G6PDH的成员之一,含有NADP结合区和G6P结合区2个保守功能域,具有多个磷酸化位点和跨膜区域,但不含有信号肽,表明PsG6DH可能作为膜受体而起作用。另外,G6PDH的电子表达谱分析结果发现,G6PDH在多种组织和不同发育过程均表达,并涉及各种逆境胁迫应答反应,这也说明了G6PDH在植物生长反育中的重要地位。［结论］可为下一步研究PsG6PDH基因的分子功能提供参考。     

青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鱼将DNA聚合酶β(OlPolβ)基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1 716 bp,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA的电子克隆及同源建模

[目的]研究对紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA进行电子克隆及同源建模的方法。[方法]根据物种间同源基因相对保守的特点,利用NCBI数据库,对公共EST数据库进行同源检索筛选和重叠群装配,获得拼接cDNA序列,经过ORFFinder分析后获得相应蛋白质的全长序列,并利用Swiss-Mode服务器预测各原子坐标,进而利用Swiss-PdbViewer生成三维空间模型。[结果]采用该方法成功获得紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因的完整cDNA序列,全长为1880bp,mPPI蛋白质编码68AA,分子量约为7829.9Da,理论等电点pI=8.99,原子组成为C338H547N103O103S4,摩尔消光系数280nm处为4595,不稳定系数为42.16,脂肪系数为83.24,总平均亲水性为-0.456。[结论]根据物种间同源基因序列对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选和拼接,是基因克隆的一条有效途径。