莱氏野村菌CQNr01微菌核的人工诱导培养

【目的】诱导莱氏野村菌的微菌核形成,为该菌靶标害虫的生物防治提供新的制剂类型和生产工艺。【方法】采用包含特定盐离子成分的液体培养基进行诱导培养,并对培养基中的碳﹑氮源浓度及碳氮比例进行优化;将微菌核干燥保存后复水测定菌核萌发率及对斜纹夜蛾幼虫的致病力。【结果】优化筛选出莱氏野村菌CQNr01微菌核诱导培养基,成功诱导莱氏野村菌菌株CQNr01产生细胞结构分化、色素沉着的微菌核结构;微菌核的产生数量受培养基中碳和氮素含量和相对比例的影响,在一定范围内,同样碳氮比情况下,低碳培养液有利于微菌核的产生。微菌核耐干燥保存,掺加硅藻土制备的微菌核制剂经干燥处理并贮存6个月吸水后仍能萌发产孢。微菌核制剂对斜纹夜蛾幼虫具有侵染活性,接种14 d后,供试昆虫的校正死亡率可达78.56%,供试浓度下,LT50约为7 d。【结论】莱氏野村菌的微菌核受特定培养基成分的诱导,获得的微菌核耐干燥且对寄主害虫具有很高的致死率,可以作为该菌生防制剂开发应用。     

斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达

【目的】克隆斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）基因,分析其序列特征,为深入研究该基因奠定基础。【方法】利用RACE末端快速扩增技术,在斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆TCTP基因的全长。根据不同物种间TCTP基因的同源性来构建进化树,并在原核细胞中对斜纹夜蛾TCTP进行表达。【结果】克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,登录号为HQ896486.1。序列分析表明,该基因cDNA全长829 bp,开放阅读框长519 bp,编码含172个氨基酸的蛋白,蛋白分子质量19.67 kD。生物信息学分析表明,斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族,与其它物种TCTP基因有很高相似性。构建重组质粒 pET32a(+)-TCTP,在大肠杆菌中表达重组蛋白,确定了1 mmol•L-1 IPTG诱导4 h为重组蛋白表达的最佳条件,在短期内能得到大量稳定性好的TCTP蛋白。【结论】从斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,并且成功在原核细胞中进行表达。本研究为深入研究斜纹夜蛾TCTP的功能以及针对斜纹夜蛾TCTP基因RNAi干扰的生物防控提供了理论依据和技术支持。     

莱氏野村菌LX050908001C菌株对斜纹夜蛾幼虫致病性的研究

明确莱氏野村菌LX050908001C菌株对斜纹夜蛾幼虫的致病性,为该菌株在农业害虫防治中的开发应用及后续研究奠定基础.采用浸渍法进行莱氏野村菌LX050908001C分生孢子液对四龄和五龄斜纹夜蛾幼虫致病性测定.结果表明,莱氏野村菌LX050908001C对四龄幼虫的最高累计校正死亡率为92.47%.LC50为(1.341±0.052)×104个/mL,LT50为4.146±0.010 d;而对五龄幼虫的最高累计校正死亡率为84.76%,LC50为(4.410±0.658)×104个/mL,LT50为4.547±0.027 d.莱氏野村菌LX050908001C菌株对斜纹夜蛾四龄幼虫的致病性高于五龄幼虫的致病性.     

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因的发育表达分析

[目的]分析斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因(SlitPDI)的序列特征和发育表达模式,为解析SlitPDI蛋白在斜纹夜蛾生长发育过程中的生理功能提供依据.[方法]采用DNASTAR对SlitPDI基因序列特征和进化关系进行分析,并以实时荧光定量PCR研究SlitPDI基因在斜纹夜蛾2龄、4龄、6龄幼虫及蛹和新羽化雌、雄成虫共6个不同发育时期的相对表达量.[结果]SlitPDI基因编码494个氨基酸,预测该蛋白分子量约55.3 kD,理论等电点(pI)为4.52.氨基酸序列分析结果表明,SlitPDI蛋白序列具有PDI家族的典型特征:在序列的N端及C端均具有二硫键/巯基氧化还原位点-CGHC-.系统发育进化树分析结果表明,SlitPDI蛋白与意大利蜜蜂(Apis mellifera)的PDI蛋白序列一致性最低,为50.2%;与家蚕(Bombyx mori)的PDI蛋白序列一致性最高,为83.4%.斜纹夜蛾不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,SlitPDI基因在4龄幼虫中的表达量最高,其表达量是基准含量2龄幼虫的1.27倍;在刚羽化雌、雄成虫的表达量也较高,分别为基准含量2龄幼虫的1.03和1.12倍.[结论]SlitPDI蛋白属于I类PDI家族蛋白,SlitPDI基因在斜纹夜蛾4龄幼虫和新羽化成虫中的表达量相对较高.     

莱氏野村菌Nr0815对不同龄期斜纹夜蛾幼虫的毒力

【目的】探明莱氏野村菌Nr0815对不同龄期斜纹夜蛾幼虫的毒力。【方法】采用浸渍法分别测定莱氏野村菌菌悬液对斜纹夜蛾2~5龄幼虫的致病死亡率。【结果】从校正死亡率来看,对同一龄期斜纹夜蛾幼虫接种时,幼虫的校正死亡率均随着接种浓度的升高而增加,不同接种浓度间幼虫的校正死亡率均存在显著性差异(P0.05);各龄期间的校正死亡率在10~7 m L–1接种密度下无显著性差异(P0.05),10~3~10~6和10~8 m L–1接种密度下均存在显著性差异(P0.05);且以2龄幼虫的校正死亡率最高。从致死中密度来看,不同龄期的致死中密度LC50间存在极显著性差异(P0.05)。且龄期敏感性随龄期的增大而减弱;对2~5龄幼虫的LC50分别为(2.63±0.25)×10~4、(4.79±0.18)×10~5、(8.04±0.21)×10~5、(2.20±0.25)×10~6 m L–1。从致死中时来看,接种密度为2.18×10~8 m L–1时,对2~5龄幼虫的致死中时LT50分别为4.72、6.24、6.09、6.88 d。【结论】莱氏野村菌Nr0815对斜纹夜蛾2~5龄幼虫具有一定的致病效果,且对2龄幼虫的致病力最强。     

不同地域莱氏野村菌的培养性状及对斜纹夜蛾的毒力

研究了来自山东、安徽、河南的3株莱氏野村菌在PDA培养基上的生物学性状,并测定了它们对斜纹夜蛾3龄幼虫的毒力。结果表明：3株莱氏野村菌的菌落形态类似,但产孢量差异显著,其中以来自安徽的菌株Nr19的产孢量最高,为1.64×108个/cm2;3株莱氏野村菌对斜纹夜蛾幼虫都有明显的致病效果,致死率和僵虫率分别达到95%和80%以上,其中以Nr19菌株的综合致病效果最好,对斜纹夜蛾3龄幼虫的校正死亡率和僵虫率分别为97.62%和84.09%,半数致死时间(LT50)为4.044 1 d。     

桔小实蝇二硫键异构酶基因的克隆及其发育表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）二硫键异构酶（pro-tein disulfide isomerase,PDI）基因的cDNA序列,命名为BdorPDI。测序结果表明,BdorPDI开放阅读框全长1 497bp,编码498个氨基酸。氨基酸序列结构分析表明,该序列有PDI蛋白家族的典型特征:N端含有信号肽序列;在序列的N端及C端具有二硫键/巯基氧化还原位点CGHC;在C末端含有内质网滞留信号肽KDEL。进化树分析表明:桔小实蝇的PDI蛋白序列与脊椎动物安乐蜥（Anolis carolinensis）的序列（XP₀03217370）一致性最低,为49.3%;与双翅目昆虫刺舌蝇（Glossina morsitans）的序列（ADD20271）一致性最高,为76.3%。荧光定量PCR分析表明:BdorPDI mRNA在桔小实蝇1～3龄幼虫中的表达量相对较低,且呈逐渐增长的趋势;在1d蛹中的BdorPDI mRNA表达量达到最高峰,其表达量是基准含量的536.50倍,且随着蛹的发育,BdorPDI mRNA表达量呈逐渐降低的趋势。由此可见,桔小实蝇二硫键异构酶在化蛹过程中发挥了重要的生理功能。     

Cloning and developmental expression pattern analysis of PDI in Bactrocera dorsalis (Hendel)

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)基因的cDNA序列,命名为BdorPDl.测序结果表明,BdorPDI开放阅读框全长1497bp,编码498个凉基酸.氨基酸序列结构分析表明,该序列有PDI蛋白家族的典型特征:N端含有信号肽序列;在序列的N端及C端具有二硫键/巯基氧化还原位点CGHC;在C末端含有内质网滞留信号肽KDEL.进化树分析表明:桔小实蝇的PDI蛋白序列与脊椎动物安乐蜥(Anolis carolinensis)的序列(XP_003217370)--致性最低,为49.3％;与双翅目昆虫刺舌蝇(Glossina morsitans)的序列(ADD20271)一致性最高,为76.3％.荧光定量PCR分析表明:BdorPDI mRNA在桔小实蝇1～3龄幼虫中的表达量相对较低,且呈逐渐增长的趋势;在1d蛹中的BdorPDI mRNA表达量达到最高峰,其表达量是基准含量的536.50倍,且随着蛹的发育,BdorPDImRNA表达量呈逐渐降低的趋势.由此可见,桔小实蝇二硫键异构酶在化蛹过程中发挥了重要的生理功能.     

不同植食性昆虫危害棉花后棉株5种防御基因表达变化

 【目的】了解棉花体内5种防御蛋白基因在棉花防御植食性害虫中的作用。【方法】使用定量PCR分别测定棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾危害和机械损伤0（未处理的对照）、6、12、24、48、60 h后,多酚氧化酶（PPO）、叶绿体铜/锌超氧化物歧化酶、ATP合酶β亚基、捕光蛋白复合物Ⅱ、热激蛋白（Hsp70）等5种棉花防御蛋白基因表达量的变化。【结果】在4种危害处理试验中,多酚氧化酶、热激蛋白和叶绿体铜/锌超氧化物歧化酶对昆虫的取食危害应答较强,捕光蛋白复合物Ⅱ对机械损伤的应答较强,ATP合酶β亚基对昆虫的取食危害和机械损伤应答都较强。PPO对棉铃虫危害应答较快,对甜菜夜蛾危害的应答反应较为迟钝,对斜纹夜蛾的危害没有特异的应答。经过上述4种处理,棉花体内Hsp70表达量都有明显的反应,对棉铃虫和甜菜夜蛾危害反应上调较大。ATP合酶β亚基在受到对机械损伤和斜纹夜蛾危害后表达量下调,而在受到棉铃虫和甜菜夜蛾危害后表达量上调。捕光蛋白复合物Ⅱ在受到对机械损伤、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾危害后表达量下调,而在受到棉铃虫危害后表达量上调。叶绿体铜/锌超氧化物歧化酶在受到对机械损伤和斜纹夜蛾危害后表达量下调,而在受到棉铃虫和甜菜夜蛾危害后表达量上调,该基因对斜纹夜蛾危害的应答较强,对甜菜夜蛾危害特异性应答较弱。【结论】棉花对于不同昆虫的危害所产生的应答响应不同,具有一定的专一性。     

虫酰肼对斜纹夜蛾幼虫多巴脱羧酶基因表达的影响

【目的】克隆斜纹夜蛾（Spodoptera litura）多巴脱羧酶（dopa decarboxylase,DDC）基因cDNA全长,研究虫酰肼对表皮形成过程中多巴脱羧酶基因表达的影响。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长;通过生物信息学工具对斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列进行分析;采用饲料浸毒法测定虫酰肼对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的毒力;利用荧光实时定量PCR检测用亚致死剂量虫酰肼处理的斜纹夜蛾幼虫DDC基因的表达水平。【结果】克隆了斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长,开放阅读框为1 263 bp,编码420个氨基酸,5′端非编码区长105 bp,3′端非编码区长79 bp。克隆得到的cDNA全长提交至GenBank,登录号为KF620492。多重序列比对及系统进化树显示斜纹夜蛾DDC基因推导的氨基酸序列与鳞翅目昆虫的DDC序列具有很高的相似性。利用SWISS-MODEL在线工具进行同源建模,成功预测斜纹夜蛾DDC三维结构,其与果蝇属（Drosophila）的多巴脱羧酶空间结构具有很高的相似性,功能结构域具有良好的保守性。测定虫酰肼对斜纹夜蛾3、4、5和6龄幼虫的毒力,其LC50分别为33.32、40.28、71.20和71.97 mg•L-1。DDC转录表达结果显示,用虫酰肼分别处理12-48 h,4个亚致死剂量（7.50、16.24、28.34和45.63 mg•L-1）诱导的DDC表达水平均显著高于对照,随着处理时间的延长激活作用呈现出先上升后下降的趋势,其中16.24 mg•L-1亚致死剂量在24、36和48 h诱导表达水平最高,各处理36 h表达水平最高。处理60 h,4个亚致死剂量的表达水平均显著低于对照。这一结果说明虫酰肼进入虫体后先启动基因表达,而后抑制表达,影响昆虫正常蜕皮。【结论】克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因cDNA全长,虫酰肼干扰昆虫幼虫蜕皮与其影响表皮形成过程中多巴脱羧酶基因的表达有关。     

莱氏野村菌对甜菜夜蛾3龄幼虫的毒力测定

采用喷雾法测定莱氏野村菌不同浓度孢子对甜菜夜蛾3龄幼虫的致病性。结果表明,在4.2×108个/ml浓度下,8d后莱氏野村菌对甜菜夜蛾3龄幼虫的最大致死率达88.57%,其致死中时间为4.25d,致死中浓度为2.43×105个/ml。     

条锈菌诱导的小麦TaOZR的克隆及特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中差异不显著,在非亲和互作中诱导表达;外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸、茉莉酸均诱导TaOZR的积累并上调表达;低温、干旱、高盐非生物胁迫下TaOZR表达差异不显著。【结论】首次克隆到一个条锈菌诱导的小麦TaOZR,TaOZR可能通过水杨酸、乙烯、脱落酸和茉莉酸信号途径协同参与小麦对条锈菌的早期防御。     

玉米PDI基因cDNA的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术,从玉米花丝中克隆得到了玉米蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因cDNA编码序列(GenBank登录号为EF532321)。生物信息学技术分析表明:该序列开放阅读框为1 542个碱基,编码513个氨基酸,组成的蛋白质分子式C2577H3980N648O771S11,分子量为56.7 kDa,等电点pI为5.01。基因进化树分析表明玉米中的PDI基因与水稻中的PDI基因具有较近的亲缘关系。亚细胞定位预测分析表明,该基因编码的蛋白定位于细胞的内质网。     

绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）雷帕霉素靶标全长基因（AlTOR）,研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素（20E）诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础。【方法】RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot评价该抗体的特异性。【结果】AlTOR的开放阅读框编码包含435个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域;AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达。经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带。进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究。【结论】AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后,AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。     

寄主对斜纹夜蛾实验种群生殖力的影响

【目的】斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius是一种多食性害虫,繁殖能力强,全球范围内均有分布。但是寄主对斜纹夜蛾繁殖力影响机制还不清楚。开展寄主对斜纹夜蛾实验种群生殖力的影响研究,为斜纹夜蛾的预测预报以及防治提供理论依据。【方法】通过单头饲养的方法,研究斜纹夜蛾取食甘蓝、空心莲子草和地瓜后的产卵量、卵黄原蛋白(Vg)及卵黄原蛋白受体(VgR)表达的变化。【结果】幼虫取食不同寄主的成虫寿命和产卵前期没有显著性差异,但成虫的产卵量、Vg及VgR表达量有显著差异。取食人工饲料的斜纹夜蛾产卵量最多,为(889±43.0)粒,其次为取食地瓜(496±53.1)粒、空心莲子草(362±37.3)粒,和甘蓝(193±9.7)粒。取食甘蓝、空心莲子草和地瓜的斜纹夜蛾雌虫卵巢Vg和VgR的相对表达量仅为取食人工饲料斜纹夜蛾的40%～80%,且取食不同寄主的斜纹夜蛾Vg和VgR的相对表达量与产卵量呈正相关关系。【结论】斜纹夜蛾取食不同寄主后,其卵巢内的Vg和VgR表达量存在差异,从而影响到斜纹夜蛾卵子发育,最终造成其生殖力存在差异。     

小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的克隆与功能分析

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。     

小麦TaMlo8基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦Mlo基因家族新成员,分析其编码蛋白的结构、进化地位以及其在小麦根、茎、叶组织和生物胁迫下的表达模式。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从小麦品种"水源11"中分离出1个Mlo的cD-NA序列基因,对其进行克隆和序列分析;利用InterProScan、TMpred、SignalP等在线分析工具,预测TaMlo蛋白的保守结构域、跨膜结构、信号肽、细胞定位等特征;采用DNASTAR软件分别进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析,并利用qRT-PCR技术对其表达谱进行分析。【结果】以玉米ZmMlo8基因为种子序列,克隆了小麦新基因TaMlo8(暂命名)cDNA序列,该序列长1 897bp,ORF为1 497bp,编码499个氨基酸;InterProScan和SignalP预测结果显示,其为Mlo家族成员,含信号肽和7个跨膜区;BLASTX结果显示,TaMlo8与玉米ZmMlo8蛋白的相似性达78%;系统进化树显示,TaMlo8与玉米ZmMlo8处于同一分支下,而与小麦其他Mlo家族成员处于不同的分支上,进一步说明TaMlo8为小麦Mlo家族的新成员;表达谱分析表明,TaMlo8是组成型低表达,在小麦根、茎、叶组织中的表达量基本一致,在小麦与条锈菌互作的非亲和体系中诱导表达,在小麦与白粉菌的感病反应中诱导表达。【结论】克隆到1个小麦Mlo基因新成员TaMlo8,其在小麦与条锈菌的抗性反应和小麦与白粉菌的感病反应中起一定作用,说明TaMlo8基因对条锈菌和白粉菌的抗病路径可能不同,为进一步研究其在小麦生物胁迫反应中的潜在功能奠定了基础。     

营养物质对莱氏野村菌MZ060806生长的影响

【目的】了解不同营养物质对莱氏野村菌生长的影响,为其开发利用奠定基础。【方法】以查氏培养基为基础培养基,研究不同碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、甘露醇、可溶性淀粉)、氮源(酵母浸粉、尿素、牛肉蛋白胨、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵、水解酪蛋白、胰蛋白胨、硝酸铵)、维生素(抗坏血酸、硫胺素、烟酸、吡哆醇、核黄素、生物素、泛酸)及不同碳氮比(5∶1,10∶1,15∶1,30∶1,60∶1,120∶1,240∶1,480∶1)对莱氏野村菌MZ060806菌株菌落直径、菌丝干质量和产孢量的影响。【结果】适宜莱氏野村菌MZ060806菌落生长的最佳碳源是蔗糖,氮源是水解酪蛋白,碳氮比是15∶1,维生素是生物素;有利于菌丝生长的最佳碳源是可溶性淀粉,氮源是酵母浸粉,碳氮比是15∶1,维生素是泛酸、核黄素和抗坏血酸;明显促进产孢量增加的最佳碳源是葡萄糖,氮源是水解酪蛋白,碳氮比是15∶1,维生素是硫胺素。【结论】明确了促进莱氏野村菌MZ060806菌落扩展、菌丝生长和产孢的最佳碳源、氮源、维生素种类及碳氮比。