抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术及其在鸡单链抗体中的应用

抗体工程经历过多克隆血清，单克隆抗体阶段，现发展到了基因工程抗体时代。目前，抗体工程领域最突出的进展就是噬菌体抗体库技术的建立。噬菌体抗体库技术实际上是丝状噬菌体展示技术(phage display technology)与抗体组合文库技术(combinatorial immunoglobulin library     

天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建

噬菌体展示技术是一项利用丝状噬菌体体外表达外源基因的新技术。它模拟动物体内抗体的形成过程，将抗体片段呈现在噬菌体表面，建成噬菌体抗体库，用与亲和层析相类似的原理，从抗体库中筛选出特异性噬菌体抗体，为制备人和动物用抗体提供了极为有效的手段。单链抗体是利用基因工程技术，由一个DNA片段(Linker)将抗体重链、     

抗庆大霉素噬菌体抗体库的构建和筛选

本研究使用噬菌体抗体库技术筛选针对庆大霉素（gentamicin）的单链抗体。以抗庆大霉素杂交瘤细胞株（2A3）为基因来源构建scFv基因,连接至pCANTAB5E噬菌粒载体,通过电击转化TG1（Escherichia coli TG1）构建了库容量为6.5×106噬菌体单链抗体库。抗庆大霉素噬菌体单链抗体库进行三轮富集筛选,通过Phage-ELISA技术成功筛选出了9个抗庆大霉素噬菌体阳性克隆,为开发新型残留检测用抗体奠定了基础。     

抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体是表面表达有单链抗体（Singlechain Fv,ScFv）或抗体Fab段的噬菌体,用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬菌体表面成为噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库.该技术是丝状噬菌体展示（phage display）与抗体组合文库技术相结合而成.其基本路线为用PCR方法扩增抗体全套可变区基因,重组到噬菌体载体中,并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,把Fab段或ScFv表达到噬菌体表面.通过＂吸附-洗脱-扩增＂的富集过程,从中筛选出特异性抗体的可变区基因.     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒（CDV）的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1：25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10⁹ PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

抗猪流感病毒单链抗体的原核表达及活性分析

为了深入研究抗猪流感病毒(SIV)单链抗体(scF v)的功能,以及抗体的放大生产和应用,在获得特异性抗体SIV scF v编码基因的基础上,建立该单链抗体的原核高效表达体系,并对表达产物进行复性纯化和活性测定。通过PCR从重组噬粒中扩增抗scF v基因,将其克隆到原核表达载体p ET28a(+)中后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明重组scF v主要以包涵体形式表达,经过复性和纯化可获得可溶性的重组scF v,分子质量约为33 ku。间接ELISA和阻断ELISA表明,复性后的scF v与包被在酶标板上的SIV具有特异的结合反应,且具有浓度依赖性。重组scF v可以与其他2株SIV国内分离株特异性结合,提示重组scF v可能针对的是该病毒的保守区域。本研究成功获得了具有中和H1N1猪流感病毒活性的重组抗SIV scF v,为深入研究其功能以及进行大规模生产应用提供依据。     

单链抗体的研究进展

抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用,其生产制备经历了抗血清多克隆抗体和单克隆抗体(Monoclonalantibodies,McAb)阶段,现已进入了基因工程抗体的时代。基因工程抗体主要包括单链抗体(ScFv)、Fab抗体、F(ab`)2抗体等小分子抗体、嵌合抗体和改形抗体。本文就单链抗体的研究进展作了综述。     

丝状噬菌体与噬菌体展示技术在抗体库中的应用

丝状噬菌体展示技术是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒的表面。自问世以来,它已被应用于生物科学的许多领域,其中最具吸引力的是抗体工程,利用该技术可构建不同的抗体库,从而获得针对不同抗原的抗体。本文着重介绍了丝状噬菌体的生物学特征...     

抗磺胺二甲氧嘧啶VHH抗体噬菌体库的构建和鉴定

旨在制备抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)驼源单域重链(VHH)抗体,用于检测动物源性食品中SDM的残留.采用重氮化法,SDM分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原(SDM-BSA)和包被抗原(SDM-OVA).用SDM-BSA免疫骆驼,在第5 次免疫后1周采集骆驼外周血液,分离外周血淋巴细胞,...     

抗非洲猪瘟病毒噬菌体展示单克隆抗体的筛选及表达

为构建抗非洲猪瘟病毒(ASFV)噬菌体单链抗体文库,并获得抗ASFV的单链抗体,本试验利用自然感染ASFV猪的外周血淋巴细胞提取的mRNA,反转录获得cDNA后分别扩增出猪IgG抗体重链和轻链的可变区基因,构建scFv单链抗体后连接至pComb3XSS载体,构建噬菌体抗体展示文库,经过3轮“吸附、洗脱、富集”的筛淘过程,成功获得1株能够与ASFV蛋白特异性结合的抗体,并验证了该抗体的反应能力。根据筛选得到的可变区序列构建完整抗体使用HEK293A细胞进行真核表达与验证。结果表明,成功构建了库容量约为9.2×10¹¹PFU/mL抗ASFV噬菌体单链抗体文库,筛选并得到1株与ASFV病毒蛋白亲和性较高的单链抗体,使用真核表达系统成功表达了该株重组抗体。该研究为ASFV的诊断和治疗奠定了一定基础。     

东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础.用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA.在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端.用Mini Column纯化、收集300 bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库.经测定,库容量为1.3×107 PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011 PFU/mL.对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200 bp～1 000 bp,其中有95.5%的插入片段大于300 bp.用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%.     

噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

为了研究副猪嗜血杆菌（HPS）外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和West—ernblot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。     

Generation of recombinant antibody fragments that target canine dendritic cells by phage display technology

One of the main goals in cancer immunotherapy is the efficient activation of the host immune system against tumour cells. Dendritic cells (DCs) can induce specific anti-tumour immune responses in both experimental animal models and humans. However, most preclinical studies using small animal models show only limited correlation with studies carried out in clinical settings, whereas laboratory dogs naturally develop tumours that are biologically and histopathologically similar to their human counterparts. Here, we describe the generation and characterization of recombinant antibodies against canine DCs, isolated using the Tomlinson phage display system. We successfully isolated highly specific single-chain variable fragment (scFv) antibodies in a sequential three-step panning strategy involving depletion on canine peripheral blood mononuclear cells followed by positive selection on native canine DCs. This provides the basis for an antibody-based method for the immunological detection and manipulation of DCs and for monitoring antigen-specific immune responses.     

猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立

猪流感病毒A／Swine／Fujian／668／2001（H3N2）株感染的鸡胚尿囊液，经差速离心后，再经蔗糖密度梯度离心，提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融，作为猪流感间接ELISA抗原，确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测，经统计学分析，确定间接ELISA判定标准，被检血清OD490nm值≥0．20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应，批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3．34％～8．12％和6．2％～9．04％之间。与HI的符合率达到92．8％，经卡方检验（P〈0．01）比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。     

广东部分地区H1和H3亚型猪流感抗体监测和病毒分离

从广东省17个未免疫猪流感病毒(SIV)疫苗的规模化猪场和3个肉联厂的待屠宰猪群中采集2 155份血清样品,采用ELISA方法进行猪流感的血清学调查。结果发现,种猪和肉猪H1亚型猪流感抗体阳性率分别为39.6%(329/830)和37.6%(498/1325),H3亚型抗体阳性率分别为10.8%(90/830)和4.6%(61/1325),H1+H3阳性率分别为5.2%(43/830)和1.8%(25/1325)。从281份猪鼻拭样品和肺样品中分离并鉴定出5株猪流感病毒,其中H1N1亚型3株,H3N2亚型和H1N2亚型各1株。     

猪流感病毒研究进展

猪流感是由猪流感病毒引起的一种呼吸道传染病。目前 ,此病在世界各地都有发生 ,危害严重 ,经济损失巨大 ,并对人类的健康构成威胁。猪流感病毒属于正黏病毒科 A型流感病毒属 ,病毒粒子多形态。该病毒对热、消毒剂敏感 ,而对干燥和低温的抵抗力强大。其分子特性为多节段的 RNA病毒 ,由 8个片段组成 ,分别编码 1 0种蛋白质。猪流感病毒能够在多种动物的细胞上增殖 ,但病毒分离和疫苗生产时 ,经常采用鸡胚接种。病毒具有血凝活性 ,但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力很大 ,因此病毒的变异频繁 ,其机理涉及分子水平的抗原漂移和抗原转变。文章对病毒的理化、生物学特性、分子特性、病毒的蛋白和基因变异等方面的研究情况进行了综述     

噬菌体展示系统的构建及其在疾病防控领域应用研究进展

噬菌体展示技术作为目前应用广泛的展示抗体技术,逐渐成为生产基因工程抗体的重要工具。噬菌体展示技术是以噬菌体或噬菌粒为载体,通过将外源多肽基因整合到噬菌体基因中,以融合表达的形式将外源蛋白展示在噬菌体表面的分子生物学技术。近年来,噬菌体展示技术在抗体筛选领域的应用越来越广泛,与传统制备抗体的方法相比,噬菌体展示技术具有通量高、成本低、操作简单等特点,且通过该技术筛选得到的抗体不仅可在标签蛋白的辅助下进行选择和纯化,还可通过基因测序的方法得到单链抗体的完整基因序列。笔者首先对噬菌体抗体库进行分类,根据抗体的来源将噬菌体抗体库分为天然抗体库和免疫抗体库,通过免疫动物制备的抗体文库的特异性、抗体阳性率明显高于天然抗体文库;其次简述了噬菌体抗体库的构建流程,其中噬菌体表达载体的选择是展示技术的关键,整合了噬菌粒基因的辅助噬菌体侵染其特异性菌株,从而通过抗生素平板对该系统进行选择性筛选;最后讨论了噬菌体展示技术在疾病防控领域应用的研究进展,抗体的首次人源化使同源性抗体在临床上应用成为可能,后续用于预防和治疗病毒性疾病的动物同源性抗体的研发进一步证明了噬菌体展示技术用于生产诊断或潜在治疗试剂的能力。该综述主要聚焦于噬菌体展示系统的构建及其在疾病防控领域的应用,以期对后续通过噬菌体展示技术筛选单链抗体的应用提供指导。