云南三台核桃ISSR体系优化

试验以云南三台核桃幼叶为试材提取基因组DNA,并用正交设计方法,比较了Taq酶、Mg2+、引物d、NTPs和DNA模板等5因素5水平共25个反应体系的ISSR-PCR扩增结果。确定三台核桃ISSR-PCR的反应体系为:20μL反应体系中Taq酶0.25 U、Mg2+为2.0 mM/L、引物0.8μM/Ld、NTPs 0.4 mM/L1、0×PCR Buffer 2μL和10 ng模板DNA。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行三台核桃遗传图谱的构建、基因定位、种质资源鉴定与分类和遗传多样性分析奠定了技术基础。     

温郁金RAPD-PCR反应体系建立及条件优化

在提取纯化温郁金DNA的基础上,利用PCR扩增技术,对Mg2 、dNTP、模板DTA、引物、Taq聚合酶等反应条件进行优化,建立温郁金基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系.结果表明:最佳条件是总体积为25μL,其中Mg2 (25mM)2μL,Taq 聚合酶(5 U/μL)0.3μL,引物浓度(20μM)1.0μL,模板DNA(5 ng/μL)1.0μL,dNTP(2.5 mM)2.0μL,10×PCRbuffer 2.5μL;PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性35 s,36℃退火1min,72℃复性1.5 min,共42个循环;最后72℃延伸10 min,该研究得出的体系是温郁金RAPD-PCR的最适宜反应体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带较清晰、稳定等特点,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础.     

杏ISSR反应体系的优化和指纹图谱的构建

以杏品种清密沙为试材,用引物UBC825〔序列为(AC)8T〕研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对杏ISSR扩增结果的影响。结果表明:Primer、Mg2+、Taq酶浓度对扩增效果有明显影响,而模板DNA和dNTPs含量对扩增结果影响不大。优化的反应体系为:20μL的反应体系中含10ng模板DNA、0.1mmol/LdNTP、0.25μmol/LPrimer、2.5mmol/LMg2+,0.5UTaqPolymerase。适宜退火温度为50-52.1℃。用引物UBC825和UBC868〔序列为(GAA)5〕在优化的反应条件下建立了5个种12份杏材料的ISSR指纹图谱。     

柑桔溃疡病菌的PCR检测方法研究

通过优化PCR反应条件,拟建立快速、特异、准确的检测柑桔溃疡病的方法。试验结果表明,25μL优化反应体系:10×PCR缓冲液2.5μL,10 mM/L dNTPs 0.5μL(终浓度为0.2 mM/L),2 U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL(终浓度为0.04 U/μL),5 mM/L引物各0.5μL(终浓度为0.1 mM/L),DNA模板1μL(终浓度为6.0×10~6cfu/mL/mL),灭菌ddH_20 19.5μL;PCR扩增退火温度为59℃;柑桔溃疡病菌病茵浓度检测下限为6.0×10~3cfu/mL,可以获得柑桔溃疡病菌的特异性片段,能够满足生产中对柑桔溃疡病检测的要求。     

番茄EST-SSR标记PCR反应体系的优化

应用L16 (44)正交实验优化番茄EST-SSR标记PCR反应体系.结果表明:20 μL体系中各反应物最适浓度为:DNA模板45 ng/20μL,引物0.75 μmol/L,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs0.4 mmol/L,Taq DNA酶0.5 U/20μL,且Mg2+对该标记反应体系影响最大.利用5对EST-SSR引物及P1、P2基因组DNA验证优化体系的可靠性,为该标记在番茄基因组分子标记辅助育种提供了试验依据.     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及DNA模板浓度进行优化。结果表明,20μL反应体系中,含Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,模板DNA 30mg/L,引物1.00μmol/L和Taq DNA聚合酶0.4U为最佳反应体系。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

湖南地方辣椒品种RAPD体系的正交优化研究

以辣椒DNA为模板,对影响辣椒RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立辣椒RAPD反应的最佳体系.通过采用正交试验设计的方法,对辣椒RAPD条件进行了优化,结果表明:最佳的辣椒RAPD的反应体系(15μL)中含有1×buffer,MgCl2 2.67 mM,dNTPs 0.13mM,Primer 0.5μmol/L,Taq 0.75 U/μL,DNA 40～50 ng.适宜扩增条件为94℃预变性4 min,再进入40个PCR循环94℃变性1 min,37℃退火45 s,72℃延伸1 min,72℃延伸10 min,4℃保存.     

小干松SRAP-PCR反应体系的建立

以小干松针叶基因组DNA为模板,采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Taq酶、Mg2+、dNTPs、模板DNA和引物5个因素在4个水平上进行优化.结果表明:小干松SRAP-PCR 20 μL反应体系最佳组合为:Taq酶0.5U,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTPs浓度0.15 mmol/L,模板DNA含量60 ng,引物0.2μmol/L.使用12对SRAP引物,采用优化后的体系进行SRAP-PCR反应,表明优化的体系很好地满足了小干松基因组DNA进行SRAP的扩增要求.     

偃麦草SRAP-PCR反应体系优化

以偃麦草叶片DNA为模板,利用单因子和L16(45)正交实验设计对影响偃麦草SRAP-PCR反应效果的Mg2+、引物、dNTPs、DNA、Taq DNA聚合酶5种因素进行优化,并比较了不同退火温度对扩增反应的影响,通过综合比较分析建立偃麦草SRAP-PCR的优化反应体系。结果表明:优化的偃麦草SRAP-PCR总体系20μL中,Mg2+1.75 mmol/L,引物0.15μmol/L,dNTPs 0.20mmol/L,DNA 50ng,Taq DNA聚合酶0.75U,2μL 10×PCR buffer;Mg2+和引物浓度对扩增效果影响最大,DNA浓度影响最小;采用该体系对32份偃麦草进行验证,扩增结果清晰稳定,此体系的建立为利用SRAP分子标记进行偃麦草遗传多样性、抗性标记等研究奠定了技术基础。     

番石榴最适ISSR-PCR反应体系的建立与验证

为更好地将ISSR标记应用于番石榴种质研究,以"维邦2号"番石榴DNA为筛选体系试验材料,采用单因子试验对ISSR-PCR反应中Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度、DNA浓度进行了优化;选用引物UBC810对9份番石榴种质进行PCR反应,选取"南宁本地番石榴实生2号"DNA作为模板对8条ISSR引物进行PCR反应,对优化扩增体系进行验证。结果表明,番石榴20μL最适ISSR-PCR反应体系为1.0mmol/L Mg~(2+),0.25mmol/L dNTPs,0.8μmol/L引物,0.2U Taq酶,10ng的DNA(2.0μL 10×Buffer,加入适量ddH2O至20μL)。验证试验得到的扩增产物条带多态性丰富,且特异性强、重复性好。试验确立的最适ISSR-PCR反应体系适用于番石榴的ISSR分子标记。