应用TaqMan MGB探针检测小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌

 以小麦印度腥黑穗病菌9个菌株和黑麦草腥黑穗病菌5个菌株及其近似种或相关种:稻粒黑粉菌、狼尾草腥黑粉菌、狗尾草腥黑粉菌、苏玛特腥黑粉菌、狐尾草腥黑粉菌、小麦网腥黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌共9种22个菌株为研究对象,通过序列比对分析,设计了检测小麦印度腥黑穗病菌及黑麦草腥黑穗病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR引物和探针,优化了反应条件,筛选出特异性探针,分别建立了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌实时荧光单重PCR和实时荧光双重PCR检测方法,其中实时荧光双重PCR检测方法实现了在同一PCR管中仅用5μL的反应体系,进行1次PCR反应就能特异性检测出小麦印度腥黑穗病菌或黑麦草腥黑穗病菌。本研究所建立的检测方法特异性强、结果可靠、检测速度快、成本明显降低,在文际应用中具有推广价值。     

小麦印度腥黑穗病菌PCR检测

应用PCR方法对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种或相关种包括黑麦草腥黑粉菌、狼尾草腥黑粉菌、水稻腥黑粉菌等10种腥黑粉菌共14个菌株进行了检测研究。根据线粒体DNA的序列分别设计了扩增小麦印度腥黑穗病菌的特异性引物和扩增黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，根据核糖体内转录区（ITS）DNA片段设计了扩增腥黑粉菌属真菌的引物，应用PCR方法能将小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草腥黑粉菌及其它近似种或相关种加以区分。本方法稳定、可靠、重复性强，已分别在不同实验室的不同型号PCR仪上得到验证。     

小麦矮腥黑穗病菌与其近缘种的rDNA-ITS序列分析

本研究对小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa)及其近似种小麦网腥黑穗病菌(T.caries)、小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)的rDNA-ITS进行了测序,并结合GenBank中登录的这3个种的其他菌株及腥黑粉属其他6个近缘种41条ITS序列进行了聚类分析。结果表明,所有菌株可以被划分为3个分支:第1个分支为印度腥黑穗病菌(T. indica)与其近似种T. walkeri;第2个分支主要是小麦矮腥黑穗病菌与其近似种T. caires和T. foetida及寄生在杂草上的一些腥黑粉菌(T.bromi 和T.fusca);第3个分支主要是寄生在杂草和水稻上的腥黑粉菌(T. barclayana和T. horrida)。第1分支与第2分支之间 ITS差异较大,同一分支内不同种之间ITS差异很小。rDNA-ITS序列只能用于腥黑粉菌属中部分种的区分。     

多年生黑麦草中小麦矮腥黑穗病菌PCR 检测方法的建立

寄生于多年生黑麦草的Tilletia属腥黑粉菌共有4种,即小麦矮腥黑穗病菌Tilletia controversa（TCK）、黑麦草腥黑粉病菌T.lolii、T.vankyi、黑麦草粒腥黑穗病菌T.walkeri。本研究分析了黑麦草上冬孢子形态非常相似的3种腥黑粉菌的DNA序列差异,设计了TCK的特异引物,成功建立了TCK菌丝基因组DNA的特异PCR检测方法和冬孢子的套式特异PCR检测方法。     

进境剪股颖草种中腥黑粉菌的检验鉴定

侵染剪股颖的腥黑粉菌是我国尚未发生的一种真菌病害，也是小麦矮腥黑穗病菌(TCK)的近似种。本文介绍了该病菌的检验鉴定情况，并从冬孢子形态、自发荧光现象及萌发生理特性几方面比较了两种病菌的差异。     

基于ISSR标记开发的一种用于小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法

 小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn, 简称TCK)是小麦上的一种重要检疫性真菌。本研究利用内部简单重复序列(Inter-simple sequence repeat, ISSR)技术研究TCK及其近缘种的DNA多态性,开发了一种可靠而简单的方法用于TCK的分子鉴定。用ISSR引物P4从TCK中扩增出一条1 113 bp的特异性条带,据此设计了一对特异性引物TCKF/TCKR,在12个TCK菌株中均能扩增得到一条882 bp的特异性条带,而其他近缘种包括小麦网腥黑穗病菌(T. caries)和小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)及相关黑粉菌的14个菌株均无扩增条带。用该特异性引物检测TCK的下限为25 μL反应体系中可检测到1 ng DNA模板。本研究开发的种特异性引物,可将TCK与其形态上相似的近缘种尤其是小麦网腥黑穗病菌准确区分开,本研究基于ISSR标记建立的小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法为腥黑粉菌的检疫提供了一种便捷的方法,是对现有分子鉴定方法的一个补充。     

黑麦草腥黑粉菌分子检测方法的研究

寄生于黑麦草属植物有4种腥黑粉菌,分别是小麦矮化腥黑穗病菌(Tilletia.Controversa(TCK))、黑麦草腥黑粉菌(T.lolli)、黑麦草粒腥黑粉菌(T.walkeri)和新种(T.vankyi)。其中TCK、T.lolli和T.vankyi冬孢子形态非常相似,难以区分。本研究以寄生于黑麦草上的这3种腥黑粉菌为研究对象,设计T.lolli的特异引物,成功建立了T.lolli冬孢子的套式特异PCR检测方法。     

腥黑粉菌属3种检疫性真菌rDNA-IGS区的扩增及其序列分析

 为了发掘腥黑粉菌属检疫性真菌的特异性分子标记,本研究对来自不同地区的3种检疫性腥黑粉菌:小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa)、小麦网腥黑穗病菌(T. caries)和小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)的IGS区进行了PCR扩增和序列测定,其IGS1和IGS2区的长度分别为1 511~1 513bp和1 196~1 199bp,G+C含量分别为52.6%和49.0%。用DNA-MAN软件进行比对分析发现,这3种真菌在IGS1区存在不同程度的多态性,而IGS2区的保守性很强,没有特异性的碱基位点存在。依据它们在IGS1区序列的差异,设计了一对特异性引物,可用于T. foetida的分子检测,这是首次利用分子生物学技术对该菌进行鉴定。     

进境小麦中沙地牧草腥黑粉菌的鉴定

从上海口岸进境的澳大利亚小麦中发现一种类似小麦印度腥黑粉病菌的腥黑粉菌冬孢子，对该菌冬孢子进行了形态学特征和PCR检测，根据结果，将这种冬孢子鉴定为沙地牧草腥黑粉菌Tilletia ehghartaTle；本研究设计了T．ehrhartaea的特异引物Eh2/Eh4，结合引物Till／Til4建立了T．ehdmrtae的套式PCR检测方法。     

黑麦草粒腥黑粉病菌与黑麦草的检疫问题

黑麦草既是某些外来危险性病害如小麦矮化腥黑穗病菌的重要寄主;本身也受到很多病菌包括其他腥黑粉病菌的侵害;美国农业部在1996年至1997年继续对小麦印腥病菌疫区分布的调查中,在俄勒冈州及美国东南部等州发现了一种在形态学上非常近似于小麦印腥,但其寄主是黑麦草的病菌,进一步研究证明,此病原菌是与小麦印腥病菌非常近似的种-黑麦草腥黑穗病菌(Tilletia walkeri Castlebury and Carris 1999).本文综合了国内外对黑麦草粒腥黑粉病菌的最新研究成果,并探讨了黑麦草的检疫性保护问题.     

关于小麦矮腥病菌某些近似种的探讨

输入小麦中经常存在着相当数量的禾本科杂草种子,扩大了小麦矮腥病菌的传入寄主,也增加了某些禾草腥黑穗病随同传入的可能性。根据小麦矮腥病菌与某些禾本科腥黑穗病菌在动态方面的近似,以及在冬孢子萌发生理、寄主范围等方面的共同点,结合进口检验中禾本科杂草种子的出现频率,提出 Tille-tia caries,T.secalis,T.decipiens,T.fusca,T.elymi,T.lolii 等六种禾本科植物腥黑穗病菌为小麦黑腥病菌的近似种。     

小麦网腥黑穗病温室内人工接种方法的探索

小麦网腥黑穗病是由小麦网腥黑粉菌Tilletia caries引起,会导致小麦严重减产。为了获得小麦网腥黑穗病较高的发病率,本研究利用穗部接菌、土壤接菌、根部接菌3种方法进行温室内人工接种小麦。结果表明,利用穗部接菌及土壤接菌发病率分别为52.5%和10%,而根部接菌发病率仅有4%。利用穗部接菌可以获得更多的发病植株,为更好地研究寄主与病原的互作关系奠定了基础。     

TaqMan-MGB探针在小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌鉴定上的应用

根据小麦印度腥黑穗病菌Tilletia indica和黑麦草腥黑穗病菌T.walkeri核糖体ITS序列设计了两对通用引物和两条特异性探针,建立了小麦印腥印度腥黑穗病菌Tilletia indica和黑麦草腥黑穗病菌T.walkeri的实时荧光PCR检测方法,检测的灵敏度为1个冬孢子.这种检测方法可以直接用于样品小麦印腥和黑麦草腥黑穗病菌冬孢子的快速检测,整个检测过程缩短至1天.     

从进口草籽中截获绒毛草腥黑穗菌

本文介绍了小麦矮腥黑穗病菌（ＴＣＫ）的近似种－绒毛草腥黑穗菌（ＴＨＳ）的检验鉴定情况,并详细比较了两种黑粉菌,发现两种冬孢子萌发对温度条件要求不同。     

小麦矮腥黑粉菌及其近缘种的RPB2基因片段序列分析

以小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn）及其近缘种小麦网腥黑粉菌［T. caries （DC.）Tul.］、小麦光腥黑粉菌(T. laevis Kühn)和其他6种黑粉菌的DNA为模板,用RNA聚合酶II的第2亚基RPB2基因的通用引物RPB2-740F/RPB2-1365R进行PCR扩增。结果表明,3种小麦腥黑粉菌均能扩增出617 bp大小的DNA片段,供试的其他6种黑粉菌没有任何扩增产物。利用DNAMAN软件进行序列分析结果表明,3种小麦腥黑粉菌的RPB2蛋白基因序列的相似性为99.08%,存在17个碱基的差异。利用RPB2基因的通用引物作为小麦腥黑粉菌的内置对照引物,与小麦矮腥黑粉菌的特异引物CQUTCK2/CQUTCK3相结合可提高小麦矮腥黑粉菌检测的准确性。     

小麦矮腥黑穗病菌和普通腥黑穗病菌在几种灭活处理中的相关性分析

对小麦矮腥黑穗病菌和小麦普通腥黑穗菌(光腥和网腥)进行了60Co辐照、环氧乙烷熏蒸、直线加速器电子辐射等方法的灭活处理实验并进行了相关性分析.结果表明各处理对几种菌灭活效果基本一致.预示实验中的两种普通腥黑穗菌可做为矮腥黑穗菌的指示菌.     

从美国进口六月禾中检出狐草腥黑穗病菌

1991年1～3月甘肃草坪技术开发研究所和甘肃省草原生态研究所分4批从美国杰克林公司和美国国际种子公司引进了7400kg六月禾和普通早熟禾,我们参照小麦矮腥病菌的检验程序,进行了直接检验、洗涤检验和萌发试验,做出结论,在这3批六月禾中检出的菌为狐草腥黑粉病菌Tilletia fusca。禾本科牧草不仅是小麦矮腥黑穗病菌的野生寄主,而且在禾本科牧草上寄生的一些腥黑粉病菌都与矮腥黑穗病菌有着某些亲缘关系,所以在     

小麦矮星检疫40年——中国植物检疫案例之一(续)

2 检疫科技合作 从1966年至今40年来，为了保证实施小麦矮腥病菌的检疫立足于生物学基础，促使中国在不同时期的检疫实践中实现了对小麦矮腥病菌的系统性研究，从比较形态学及近似种界定、病菌萌发生理寻求准确有效的检验鉴定技术开始，进行了小麦矮腥病菌的生物学和寄主病理学的研究。根据中国冬麦区不同的农业气候条件，运用生物气候相似距进行小麦矮腥病菌在中国冬麦区的潜在地理适存性研究。在病菌生态学和地理植病学的研究基础上，开展了小麦矮腥病菌在中国冬麦区的定殖风险区划研究、小麦矮腥病菌侵染能力的研究，相应地研究了小麦矮腥病菌的检疫处理，形成结合中国农业生产特点的具有创造性、系统性的小麦矮腥病菌检疫研究工作，为检疫治理提供了科学基础。以下将重点摘述中国进行小麦矮腥黑穗病菌检疫科研的几个主要方面。     

小麦光腥黑粉菌转化子最适固体培养基的筛选

为了筛选小麦光腥黑粉菌转化子最适培养基, 以提高小麦光腥黑粉菌转化子生长速度, 选取了3个菌落形态不同的转化子(ZHZ-1, ZHZ-2, ZHZ-3)进行培养试验?用6 mm打孔器打取菌饼, 将菌饼置于9种培养基上16℃避光培养?观察?测量小麦光腥黑粉菌转化子的菌丝生长情况?菌落直径等主要指标, 结果表明, 9种培养基中, 3种转化子都是在完全培养基(complete medium, CM)上生长状况最好, 菌丝生长速度最快?ZHZ-1转化子在CM培养基上菌落圆形, 有褶皱, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?ZHZ-2转化子菌落圆形, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?ZHZ-3转化子菌落云纹状, 有褶皱, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?     

5种药剂对小麦光腥黑穗病菌的毒力和孢子萌发形态结构的影响

采用琼脂平板孢子萌芽法测定了卫福 200、多菌灵、烯唑醇、戊唑醇和三唑酮5种药剂对小麦光腥黑穗病菌的抑制作用和毒力,同时检测了药剂对病菌冬孢子萌发形态结构的影响。结果表明,5种药剂在一定浓度范围内对病菌孢子萌发抑制作用随着药剂浓度提高而增强,对病菌的EC50分别为 1.6102、0.3038、4.4892、1.6103和 0.3896mg·L-1,多菌灵对光腥黑穗病菌的毒力高于其它4种供试药剂。通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察表明,药剂作用下光腥黑穗病菌孢子萌发出现3种类型畸形,导致正常发育受到抑制。