沼泽型水牛ALK3基因克隆分析与表达模式研究

试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究.根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析.结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599 bp,共编码532个氨基酸.多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%.系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性.对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构.定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低.本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础.     

水牛自噬相关基因克隆、序列分析及组织表达研究

为了克隆水牛ATG5、LC3基因序列,并分析自噬相关基因在水牛各组织中的表达情况,试验采用RT-PCR技术克隆了水牛自噬相关基因ATG5、LC3序列,并对其CDS序列进行了生物学信息分析,同时利用QRT-PCR方法,对ATG3、ATG5、ATG6、ATG7、ATG12、LC3、BECN1 7个基因在胎水牛心脏、肝脏和肌肉等9种组织、成年水牛卵巢中的mRNA表达水平进行了分析。结果表明:克隆得到水牛ATG5基因序列980 bp,其中包括CDS序列828 bp,预计编码275个氨基酸;水牛LC3基因mRNA序列全长499 bp,包括CDS序列378 bp,预计编码125个氨基酸;所分析的7个自噬相关基因在10种水牛组织中均有不同程度的表达。     

水牛FGF10基因的克隆分析及其在不同组织中表达情况的研究

本实验旨在对水牛成纤维细胞生长因子10(FGF10)基因进行克隆、生物信息学分析,同时探讨其在不同组织中的表达模式。以水牛卵巢的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆得到FGF10基因CDS区全长642 bp,编码213个氨基酸。多重序列分析显示,水牛FGF10基因核苷酸序列与黄牛、羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%、99%、93%、91%和89%。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最近,并且在不同物种进化过程中具有高度保守性。QRT-PCR结果表明,FGF10在睾丸中的表达量最高,卵巢和脾脏次之,肝脏和心脏中最低。本研究成功克隆水牛FGF10基因,并检测其在水牛不同组织中的差异表达,为研究FGF10基因在水牛卵泡发育过程中的作用奠定基础。     

水牛脑源性神经营养因子基因克隆、序列分析及其在不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因序列,并运用生物信息学方法对序列的同源性、生物进化树、蛋白的理化性质及二、三级结构等进行了分析预测,同时利用QRT-PCR方法研究了BDNF mRNA在胎儿水牛及成年水牛不同组织中的表达情况。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长800bp水牛BDNF基因序列,其中编码区全长753bp,编码250个氨基酸。多重序列比对分析显示,水牛BDNF核苷酸序列与黄牛、野猪、犬、人、马、小鼠同源性分别为99%、94%、93%、90%、90%和89%;生物进化树分析显示,BDNF基因在不同物种进化过程中具有较高的保守性;BDNF蛋白理论分子质量28 173.36u,等电点9.12;蛋白二级结构由多个α-螺旋、β-折叠、T-转角及无规则卷曲组成,三级结构由多个α-螺旋、3对反向平行的β-折叠结构等构成活性中心(即NGF功能结构域)。QRT-PCR结果显示,BDNF mRNA在胎儿水牛及成年水牛的心脏、肺脏、肾脏、大脑、肌肉、卵巢、睾丸组织中都有表达,且成年水牛的表达量高于胎儿水牛。     

水牛PHB基因克隆与表达模式

本研究克隆水牛PHB(prohibitin)基因并运用生物信息学方法对其进行分析,同时初步探索其表达模式。首先应用RT-PCR技术扩增获得水牛PHB基因片段,应用生物信息学方法分析和预测了其理化性质、蛋白质二级及三级结构。测序结果表明,水牛PHB基因编码区全长948bp,推测编码272个氨基酸,理论蛋白质相对分子质量29 830,等电点为5.58。多重序列比较分析显示,水牛PHB基因核苷酸序列与牛、野猪、羊、黑猩猩、人、小鼠等相应序列相似性分别为99.4%,94.3%,97.8%,92.8%,92.9%,89.6%;系统进化树分析结果推测,PHB基因在不同物种以及进化过程中具有高度的保守性。QRT-PCR分析结果显示,水牛PHB基因在垂体、大脑、肝脏、卵巢、肌肉、肾脏和睾丸组织具有不同程度的表达,其中在肾脏表达量最高,肝脏、睾丸、卵巢和垂体次之,肌肉表达最低。对高、低活率水牛精子样本PHB基因表达进行了定量检测,结果显示高活率精子中PHB基因表达显著高于低活率精子(P0.05)。Western blot分析结果发现,高、低活率精子样品的β-actin蛋白条带清晰一致,PHB蛋白在高、低活率精子样品的表达差异显著,低活率精子样品的PHB蛋白表达下调,这与mRNA水平的检测结果一致。本研究为阐明PHB基因在水牛精子发生过程中的作用及其对水牛精子活率的影响奠定了基础。     

水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析

本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。     

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。     

水牛缝隙连接蛋白43基因克隆及表达

本研究克隆了水牛缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,对Cx43基因在水牛不同组织和不同发育阶段卵泡中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了水牛Cx43基因序列,其中编码区全长1152 bp,编码383个氨基酸,蛋白质理论分子质量43.13 ku,等电点为8.88。多重序列比对结果显示,水牛Cx43核苷酸序列与牛、羊、猪、马和人相应序列的同源性分别为99%、98%、94%、93%和92%,系统进化树分析结果推测,Cx43基因在不同物种进化过程中具有高度保守性;对水牛Cx43蛋白的二级和三级结构分析发现,其具有缝隙连接蛋白的特有结构。定量RT-PCR结果显示,Cx43在水牛卵巢组织中相对表达量最高,睾丸、肾脏、心脏和皮肤次之,肝脏和大脑表达量较低。免疫组化结果发现,Cx43蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,Cx43蛋白随卵泡发育表达逐渐增强。     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。     

水牛Smad4基因的克隆及其真核表达载体的构建

为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662 bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。     

沼泽型水牛KDM4A(JMJD2A)基因克隆分析与表达模式

旨在克隆并分析水牛赖氨酸特异性去甲基化酶4A (lysine-specific demethylase 4A,KDM4A)基因,并检测其在水牛不同组织中的表达情况,探讨KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能。提取卵巢组织的RNA,获得水牛KDM4A基因CDS区的全长序列。结果显示,水牛KDM4A基因编码区全长3 151 bp,编码1 067个氨基酸。水牛KDM4A基因与黄牛、绵羊、骆驼和家犬的同源性分别为99%,97%,92%,91%;且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。KDM4A蛋白包含369个α-螺旋,85个β-转角,409个无规卷曲和204个延伸链,为亲水不稳定的酸性蛋白。qRT-PCR结果显示,KDM4A在水牛肌肉、肺脏、卵巢、大脑、皮肤、心脏、脾脏、肾脏和肝脏组织中均有表达,其中肌肉、肺脏、卵巢中表达量较高,肝脏和肾脏中表达量较低。本研究克隆得到了沼泽型水牛KDM4A基因,并对不同组织内KDM4A进行了基础的生物信息学分析,为阐明KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能,提高水牛胚胎发育水平提供理论基础。     

水牛MYF5基因克隆分析及真核表达载体构建

本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。     

水牛骨形态发生蛋白1基因的克隆及其在不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein-1,BMP1)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还运用实时荧光定量PCR技术对BMP1基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆得到水牛BMP1基因的cDNA序列长度为3 195 bp,其中包含完整的2 967 bp的开放读码框(ORF),编码988个氨基酸。经序列相似性分析显示,水牛BMP1基因与牛、猪、马、人和小鼠相应氨基酸序列相似性分别为99%、96%、96%、96%和95%,具有很强的保守性。结合系统进化树分析结果推测,BMP1基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛BMP1蛋白的结构域预测结果发现,其存在1个信号肽区、1个前肽区、1个金属蛋白酶区、5个CUB区和2个EGF-like功能区。定量表达分析结果显示,BMP1基因在水牛心脏组织中相对表达量最高,睾丸、卵巢和生殖嵴等性腺器官表达量次之,骨头等其他组织表达量较低,肝脏表达量最低。     

版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。     

猪转化生长因子β受体Ⅱ基因克隆与组织表达特征分析

为了研究猪转化生长因子β受体Ⅱ(transforming growth factor beta receptorⅡ,TGFBR2)基因序列特征和组织表达特征,利用克隆测序技术获得二花脸猪TGFBR2基因编码区序列,采用RT-PCR技术分析二花脸猪TGFBR2基因的组织表达特征。结果显示:二花脸猪TGFBR2基因编码区序列长度为1 461 bp,编码蛋白含486个氨基酸残基,含有ec TbetaR2结构域、蛋白激酶结构域等典型的功能域;RT-PCR发现TGFBR2基因在二花脸猪下丘脑、子宫、卵巢和肌肉等12种组织中广泛表达,特别是在卵巢组织中高表达。结果表明:猪TGFBR2基因为进化上相对保守且在卵巢组织中高表达的基因。     

牦牛PLIN2基因的克隆及其在卵巢不同发情阶段的表达

试验旨在研究牦牛PLIN2基因的序列特征和表达特性,并分析其表达与不同发情时期的卵巢的相关性。根据GenBank中已知的普通牛序列,设计克隆引物,经RT-PCR扩增得到牦牛PLIN2基因序列。RT-PCR检测PLIN2基因在各个组织中的表达量,实时荧光定量PCR分析卵巢不同发情时期的表达量。结果表明,牦牛PLIN2基因的编码区长为1 353 bp,共编码450个氨基酸,为无跨膜结构的非分泌蛋白。与GenBank中已知的普通牛序列同源性达到99.4%,表明PLIN2基因在进化过程中相当保守。在牦牛的各个组织中PLIN2分布广泛,但不同组织中的表达有差异,卵巢、乳腺、胃和肾脏中相对较多,而肺脏中几乎没有表达。实时荧光定量PCR结果显示,在卵巢的不同发情时期PLIN2都有表达,且在黄体期的表达量最高,表明PLIN2基因在牦牛发情周期中起着不可忽视的作用。     

牛HSL基因的克隆和生物信息学分析

旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析。根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析。结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9%。HSL蛋白含有一个HSL-Nsuperfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性。半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达。该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考。     

凉山半细毛羊MEF2C基因克隆及组织表达

为研究凉山半细毛羊MEF2C基因在组织发育过程中的表达模式,本研究参考GenBank中牛的序列设计引物,首次克隆羊MEF2C全编码区序列。根据克隆序列,利用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR),分析MEF2C基因在凉山半细毛羊的组织相对表达量。结果表明:凉山半细毛羊MEF2C全编码区长度为1 302 bp,编码434个氨基酸,与牛、小鼠、人、猩猩、猪的同源性分别为99.5%、93%、99.8%、99.8%、99.5%,包含特定保守碱基序列MADS和MEF2结构。MEF2C基因在各组织中都有广泛的表达,大脑和背肌中表达值显著高于心脏、肝脏、皮肤,断奶期间表达值显著降低(P<0.05)。     

水牛Ghrelin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的牛、人等物种的Ghrelin核苷酸序列设计合成一对引物,以水牛皱胃组织总RNA为模板,采用RT-PCR法,扩增出Ghrelin成熟蛋白编码cDNA序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,扩增的水牛Ghre-lin基因编码序列长为351 bp,编码116个氨基酸。同源性分析表明,水牛Ghrelin基因与牛、人、猪、小鼠及绵羊基因相应序列的同源性分别为97%、79%、81%、75%和95%,氨基酸同源性与牛、羊、人、猪、小鼠分别为96%,94%,73%,76%和75%,说明Ghrelin是一组在进化上高度保守的蛋白质。水牛Ghrelin成熟蛋白cDNA的成功克隆,为进一步研究水牛Ghrelin基因结构、基因表达与调控奠定了基础。     

水牛MBD3基因克隆分析及其真核表达载体的构建

本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。