芽孢杆菌BJ-6产抗菌物质发酵条件初探

芽孢杆菌（Bacillus sp.）BJ-6分离自北京市门头沟区杏树根围土壤,它能够产生对多种植物病原真菌有强烈拮抗作用的抗菌物质。采用单因素试验和正交试验进行了发酵条件的筛选,发现：芽孢杆菌BJ-6产生抗菌物质的最适液体培养基配方为麦芽糖20g,蛋白胨10g,麸皮10g,CaCO3 10g,Na2HPO3 2g,KH2PO3 1g 和水1000ml;最适发酵条件为：接种种龄10 h、接种量1%、发酵温度30℃~35℃、转速为210 r/min、培养时间60 h和起始pH为9。     

黄曲霉毒素B1完全抗原合成及鼠源多抗血清的制备

为了合成黄曲霉毒素B1(AFB1)完全抗原,制备鼠源AFB1多克隆抗体血清。通过琥珀酰亚胺酯法在黄曲霉毒素B1(AFB1)分子上引入羧基,生成黄曲霉毒素B1肟(AFB1O)。用EDC法和DCC法合成AFB1-BSA和AFB1-OVA。采用薄层层析技术、紫外光谱技术(Uv)、SDS-PAGE鉴定完全抗原的合成。通过免疫BALB/c小鼠,获得鼠原多克隆血清,采用间接ELISA方法测定多抗血清的免疫效价,用竞争ELISA检测多克隆血清的敏感性和特异性。结果表明：免疫小鼠血清效价都在1:3200以上,其中6号鼠效价最高,到达1.28×10-4,敏感性好,半数抑制浓度IC50为22.268 ng/mL,交叉反应率低。本研究成功制备了AFB1完全抗原,获得了敏感的AFB1多克隆抗体血清,为以后制备AFB1单克隆抗体及免疫学快速检测方法奠定了基础。     

大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

解淀粉芽孢杆菌产抗菌物质发酵工艺研究

摘要：解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens）BJ-6 发酵过程中可产生对多种植物病原真菌有抑菌作用的抗菌物质,为提高该菌株抗菌物质的产量,本研究收集到应用于芽孢杆菌发酵的培养基配方18种,通过摇床培养筛选出较适宜于解淀粉芽孢杆菌BJ-6发酵的培养基7种。在此基础上,利用2号培养基对该菌株进行了5L发酵罐的发酵培养,并采用不同生化检测方法测定了发酵过程中菌体数量、蛋白产生量、碳源和氮源的消耗量随发酵时间的动态变化情况,明确了最佳发酵时间为96h以及碳氮源的补加时间为开始发酵后的8h-12h。同时,发酵罐自动记录了发酵过程中pH值和溶氧的动态变化。     

马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。     

特布他林人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定特布他林（Terbutaline,TBL）人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源TBL多克隆抗血清。分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-TBL和包被抗原OVA-TBL,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果表明半抗原TBL分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;受免6只小鼠效价均达1×10-4以上,且1号小鼠多抗血清抗TBL的IC50为55.88 ng/mL。本试验成功合成了TBL人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗血清,为TBL单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

溴氰菊酯人工抗原合成及鉴定

以二溴菊酸和3-[(4-硝基苯)氧基]苯甲醛为原料经4步反应合成了溴氰菊酯半抗原1-氰基[3-(4-氨基苯)苯基]甲基-2,2-二甲基3-(2,2-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯;用重氮化法将溴氰菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）相偶联制备免疫抗原和包被抗原,紫外吸收法估算偶联比分别为11:1和8:1;以BSA偶联物作免疫抗原免疫日本大耳白兔制备溴氰菊酯多克隆抗体,间接非竞争ELISA法测定2个抗血清效价分别为100000和80000,间接竞争ELISA法初步测定农药浓度50μg/ml时抑制率达到80%以上,为研究建立溴氰菊酯农残免疫快速测定方法奠定了基础。     

伊维菌素人工抗原的制备及鉴定

为制备伊维菌素人工完全抗原,通过对伊维菌素进行化学修饰,引入活性基团羧基,合成具有半抗原结构特征的伊维菌素半琥珀酸酯。然后采用NHS法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工免疫原IVM-BSA和检测原IVM-OVA,经SDS-PAGE和紫外光谱扫描鉴定。用人工免疫原IVM-BSA免疫Balb/c小鼠,间接竞争ELISA法测定抗血清效价。结果发现：偶联物IVM-BSA和IVM-OVA的偶联比分别为14.1:1和14.7:1,免疫小鼠抗血清效价达到1:12800,结果说明成功制备出人工完全抗原并且具有良好的免疫原性。     

蔵灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的特性研究

摘 要：探讨蔵灵菇马克斯克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的特性及其发酵动力学原理。采用单因素多水平试验,在pH4~8、温度31~43℃、底物浓度4~8 mmol/L及不同化学试剂(SDS、EDTA、尿素、Cu2+ 、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Mn2+)的条件下,胆盐水解酶与底物反应30min,检测酶活力。胆盐水解酶最适反应条件：pH为6.0、底物浓度为7 mmol/L、温度为37℃,Mn2+、Fe3+、Ca2+金属离子对酶活性有较大提高作用,其他化学试剂对酶活性影响不大。胆盐水解酶的酶促反应动力学常数Km为2.60 mmol/L。M3菌株在18~21 h进入稳定期,18h对数生长期时酶活性达到最高,表明其胆盐水解酶发酵动力学类型为生长偶联合成型。     

沙拉沙星单克隆抗体制备及鉴定

为制备敏感性好、亲和力高、特异性强的抗沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)单克隆抗体,采用碳二亚胺法合成SARA人工抗原,通过免疫BALB/c小鼠,选择血清效价高且敏感性好的小鼠,采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,筛选分泌抗SARA单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备SARA mAb,通过间接ELISA和间接竞争ELISA对SARA mAb的免疫学特性进行鉴定。结果表明:小鼠经免疫原免疫后,小鼠多抗血清效价均达到1∶128 000。选择敏感性较好的2号小鼠进行细胞融合,经多次亚克隆后,筛选出1G3、3H3两株杂交瘤细胞株,其中1G3所产SARA mAb效价较高,为1∶512 000,IC_(50)为6.34 ng/mL,亲和常数为8.55×10~8L/mol,与诺氟沙星的交叉反应率为1.06%,与其他药物交叉反应率均低于0.50%。     

几种杀菌剂和拮抗菌对葡萄白腐病的室内防治试验

葡萄白腐病是国内葡萄生产上危害严重的病害之一,为了该病害的防治,采用平皿抑菌试验的方法测定了7种常用杀菌剂和7株拮抗菌对葡萄白腐病菌的抑制作用,并采用室内离体果穗人工接种的方法测定它们在离体果实上的药效。结果发现：7种杀菌剂和2株拮抗菌对葡萄白腐病均表现一定程度的防病效果,其中,杀菌剂百菌清和多菌灵对葡萄白腐病菌抑菌活性较强,拮抗菌解淀粉芽孢杆菌BJ-6和放线菌F2的发酵液也具有较强的抑菌活性。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用

用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物，孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白。用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗。用CryIA免疫小鼠，经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11。用CryIA(c)多抗包被，B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA，并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量，结果分别为23．4ng·g-1 FW、24．7ng·g-1 FW。     

不同品种甜高粱幼苗的耐盐能力

甜高粱是一种能源作物,具有抗旱、耐涝、耐盐的特点。本研究以BJ-17、BJ-18和M-0011三个甜高粱品种（系）为材料,研究了盐胁迫对甜高粱种子萌发和幼苗生长的影响,通过高盐胁迫下甜高粱生理生化指标检测,比较分析了三个品种（系）的耐盐性,为高耐盐性甜高粱选育种提供依据。结果表明：不同浓度NaCl胁迫条件下,甜高粱种子的萌发均受到了不同程度的抑制,并有随着NaCl浓度的增加,萌发抑制的程度随之增大的趋势;在盐胁迫条件下,不同品种（系）甜高粱幼苗的六项生理生化指标呈现出以下规律：甜高粱幼苗的鲜重和株高均有所下降,甜高粱幼苗叶片电解质相对外渗率、丙二醛含量和脯氨酸含量均有所上升,甜高粱幼苗叶片叶绿素含量下降,其中叶绿素b含量下降最为明显;三个甜高粱品种（系）六项生理生化指标结果表明,BJ-18具有较强的耐盐性,BJ-17弱之,M1-00110的耐盐性最差。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

一株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定

为从土壤中分离得到高固氮效能的芽孢杆菌,为固氮微生物肥料的开发提供优良的菌株,从小麦的根际土壤中分离得到能在无氮培养基上生长的芽孢杆菌株,然后采用Touch-Up PCR（上升PCR）的方法从菌株中扩增固氮酶的nifH结构基因和用全氮比色法测定固氮效能的方法,复筛出具有nifH结构基因同时具有高固氮酶活的菌株,进一步从形态、生理生化、16S rDNA序列分析等方面对其进行鉴定。结果表明从小麦的根际土壤中初筛得到能在无氮培养基上生长的5株芽孢杆菌,然后复筛得到1株抗逆性强、具有nifH结构基因同时具有高固氮效能的菌株C₂,经鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。     

二氟沙星单克隆抗体的研制及其免疫学特性的鉴定

采用改进的碳二亚胺法,将半抗原二氟沙星(DIF)与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,,制备得到二氟沙星全抗原DIF-BSA和DIF-OVA。采用紫外（UV）,凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定; 用BSA-DIF免疫 BALB/C小鼠, 间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备二氟沙星单克隆抗体（DIFmAb）,并对其效价、亲和力和特异性等进行鉴定。结果表明,BSA与DIF偶联成功,分子结合比为1：4.7,筛选出1H10、2F12、4D8共3株敏感特异的杂交瘤细胞, 间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:5.12×102、1：3.2×101、1：2.56×102,腹水效价分别为1：2.56×105、1：1.28×105、1：6.4×104。同种亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,亲和常数（Ka）分别为2.94×1010 L/moL、1.72×1010 L/moL和1.35×1010 L/moL.亲和力最高的1H10对DIF的IC50为1.64ng/ml,单抗与其他氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应。通过试验获得高效价、敏感、特异的mAb,适用于动物性食品中DIF的残留检测的免疫学试验