农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。     

农杆菌介导的楸树遗传转化体系

【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。     

沟叶结缕草的组织培养和无性系的建立

通过研究不同基本培养基及植物生长调节组合对沟叶结缕草丛生芽诱导、增殖和愈伤组织诱导、分化的影响,建立起沟叶结缕草试管无性系。以地下匍匐根状茎的顶芽为外植株,在MS 6-BA 2 mg.L-1 NAA 0.1 mg.L-1培养基上诱导丛生芽形成,以MS KT 3 mg.L-1 NAA 0.1 mg.L-1作为继代增殖培养基,建立起丛生芽苗→不定芽发生→丛生芽苗速生试管无性系;以丛生芽苗基部为外植体,以MS 2.4-D 4 mg.L-1作为愈伤组织诱导培养基,以MS基本培养基作为愈伤组织分化培养基,建立起丛生苗→愈伤组织→愈伤组织分化→丛生苗试管无性系。试管无性系室外移栽成活率达95%以上。沟叶结缕草试管无性系的建立为细胞工程育种和基因转化的研究奠定了基础。     

孝顺竹愈伤组织诱导及植株再生

利用孝顺竹小穗和种胚为外植体,诱导出胚性愈伤组织并成功实现植株再生.对影响愈伤组织诱导和分化的基本培养基、激素种类及质量浓度等进行筛选,结果表明:愈伤组织诱导以NB,N6基本培养基附加4 mg·L-1 2,4-D较好;外植体在NB+500 mg·L-1脯氨酸+500 mg·L-1谷氨酰胺+300 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗塘+8 g·L-1卡拉胶(Carrageenan)+4 mg·L-1 2,4-D的诱导培养基上经20 d培养,小穗愈伤组织诱导率达87.30%,种胚愈伤组织诱导率为76.27%.愈伤组织预分化及分化的基本培养基以MS较适宜,经MS+30 g·L-1蔗糖+10 g·L-1卡拉胶+4 mg·L-1 KT培养基预分化7 d后,转入无激素的MS培养基上分化14 d,小穗愈伤组织仅个别长出绿色芽头;但种胚愈伤组织芽分化率可达80.0%.分化芽中有8%左右的白化苗,并伴有花叶苗出现.优化后的种胚愈伤组织预分化最佳培养基是MS+3 mg·L-1 6-BA+3 mg·L-1 KT.分化芽苗在添加2mg·L-1 NAA的MS培养基上生根良好,移栽成活率可达70%以上.     

农杆菌介导高羊茅基因转化体系的建立

以高羊茅(FestucaarundinaceaSchrebb)品系宾哥(Bingo)为材料,建立了农杆菌介导的基因转化方法。高羊茅种子在9mgL-12,4-D作用下,获得胚性愈伤组织。愈伤组织经农杆菌侵染,在30和50mgL-1的潮霉素浓度梯度下筛选,得抗性愈伤组织。组织化学染色法证实,uidA基因在抗性愈伤组织中表达:抗性愈伤组织在分化培养基中分化得到转基因植株。PCR、Southern杂交法证实外源基因已导入到高羊茅植株中。图5参37。     

热激启动子控制的FT基因诱导杨树早期开花体系的优化

为实现杨树早期开花,缩短育种周期,利用农杆菌介导的转化方法,探讨影响热激启动子控制的FT1基因转化白杨派杂种无性系的因素,优化其转化条件,并实现FT1基因的转化,采用热激诱导方法诱导2～3个月大的转基因植株早期开花。结果表明:叶盘转化前的预培养、菌液浓度、侵染时间及共培养时间对卡那霉素抗性植株再生率的影响均达到极显著水平;叶盘在愈伤组织诱导培养基上暗培养6天,然后用活化至OD600=0.5的菌液侵染60min,再在愈伤组织诱导培养基上共培养2天,该条件下FT1基因转化白杨派杂种的卡那霉素抗性植株再生率可达29.84%;37℃每天1h持续热激3周可使FT1基因顺利表达,促进转基因植株开花;热激植株大小是影响转基因植株热激诱导开花的限制因素,低于20cm的植株不能诱导开花;热激诱导可产生相对较多的正常花器,但花器变异仍然十分广泛。     

微弹介导的火炬松遗传转化

本文建立了一个微弹介导的火炬松遗传转化系统。这个系统解决了火炬松遗传转化过程中存在的许多困难。运载抗虫基因的质粒载体经微弹转化法进入火炬松成熟合子胚,然后在添加了卡那霉素的培养基上从转化的成熟胚上诱导出有器官发生潜力的愈伤组织,再从转化的愈伤组织上产生转基因植株。利用这一系统生产的转基因植株已经被随机扩增技术、Southern杂交技术和虫试验所证实,并且转化的植株已在土壤中成活。图3表2参28。     

不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响

以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料,研究6个影响杉木遗传转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为:预培养1～3 d,OD600 nm为0.1～0.4的菌液浸染10～15 min,共培养3～5 d,共培养基附加乙酰丁香酮(AS)80 μmol·L-1,共培养后延迟3 d筛选.在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素(Km)抗性芽,在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽.PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性,初步证明外源天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中.     

龙凤竹愈伤组织诱导及再分化的试验

以龙凤竹茎段为外植体,采用不同培养基进行愈伤组织诱导试验。将获得的龙凤竹愈伤组织转入再分化培养基中,采用正交设计实验,添加不同浓度6-BA、NAA和蔗糖,组成9种不同的再生植株分化培养基,对龙凤竹愈伤组织进行再分化培养。结果表明:NMB为最适的基本培养基;诱导培养基中添加6-BA 1 mg/L+NAA0.1 mg/L时,有利于龙凤竹愈伤组织形成,诱导率达86.67%;再分化率最高的培养基配方为NMB+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+5%蔗糖。     

重瓣丝石竹组织培养与栽培管理技术

利用重瓣丝石竹中3个品种“仙女”、“完美”、“火烈鸟”分别取嫩茎和顶芽作为外植体,在不同激素水平的培养基上诱导产生愈伤组织、丛生芽和根,完成植株再生。研究发现,2种外植体以项芽最好．其愈伤组织的产生的芽的分化速度较快。最后移入生根培养基上长成完整植株。同时对栽培管理技术还进行了研究和探讨。     

四川不同地区3种丛生竹叶片可溶性蛋白分析

以四川省不同地区慈竹、梁山慈竹及硬头黄竹的叶片为材料,测定叶片可溶性蛋白质含量,采用SDS-PAGE技术研究其可溶性蛋白谱带的差异。结果表明,不同地区、不同竹种叶片可溶性蛋白含量及其谱带均有差异,可溶性蛋白含量以雅安地区的梁山慈竹最高,其次为雅安荥经地区的慈竹,宜宾江安地区的硬头黄竹最低;可溶性蛋白谱带慈竹以邛崃地区的为最多,梁山慈竹以雅安地区的为最多,硬头黄竹以宜宾竹海地区的为最多。     

Factors influencing Agrobacterium-mediated embryogenic callus transformation of Valencia sweet orange (Citrus sinensis) containing the pTA29-barnase gene

Valencia sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) calluses were used as explants to develop a new transformation system for citrus mediated by Agrobacterium tumefaciens. Factors affecting Agrobacterium-mediated transformation efficiency included mode of pre-cultivation, temperature of cocultivation and presence of acetosyringone (AS). The highest transformation efficiency was obtained with a 4-day pre-cultivation period in liquid medium. Transformation efficiency was higher when cocultivation was performed for 3 days at 19 degrees C than at 23 or 28 degrees C. Almost no resistant callus was obtained if the cocultivation medium lacked AS. The transformation procedure yielded transgenic Valencia plants containing the pTA29-barnase gene, as verified by PCR amplification and confirmed by Southern blotting. Because male sterility is a common factor leading to seedlessness in citrus cultivars with parthenocarpic characteristics, production of seedless citrus genotypes by Agrobacterium-mediated genetic transformation is a promising alternative to conventional breeding methods.     

农杆菌介导的喜树遗传转化(英文)

利用农杆菌介导法将与植物纤维素合成有关的纤维素合成酶基因导入喜树体内,并对影响遗传转化效率的几个因子进行了研究,建立了有效的喜树遗传转化体系。采用预培养的外植体在OD600(0.5)的农杆菌菌液中侵染10分钟,外植体与农杆菌侵染后在再生培养基上与农杆菌共培养三天,然后转入筛选培养基,获得了最佳的转化效率。Southern杂交结果证明UGPase基因已经整合到喜树的基因组中。在最佳的转化条件下获得了 6%的转化效率。这个转化系统对于利用遗传转化对喜树进行遗传改良是非常有意义的。     

Establishment of a transgenic system in fast-growing black locust (Robinia pseudoacacia L.)

The AhDREB1 gene, cloned from Atriplex hortensis L., was transferred into black locust (Robinia pseudoacacia L.) by an Agrobacterium-mediated transformation. The results suggest that stems of black locust sub-cultured in vitro for 20 d are suitable for genetic transformation. The optimum concentrations of kanamycin and cefotaxime were 30 and 150 mg.L-1, respectively. Impor-tant factors affecting the transformation efficiency were studied by means of a L9(34) orthogonal design. An effective system for ge-netic transformation in black locust was developed as follows: the stems were pre-cultured for 2 d, immersed in the Agrobacterium solution (OD6oo = 0.7) with 10 mg'L-1 acetosyringone for 21 min and then co-cultured for 2 d. The selection pressures, changing from low to high, could improve transformation efficiency. The transgenic plants were identified by a PCR method. The PCR results indicated that the AhDREB1 gene had been integrated into the genome of black locust and two lines of the transgenic plants were obtained.     

利用农杆菌介导法获得转codA基因麻竹再生植株的研究

温度是影响植物生存和生长发育的基本环境因子之一。大多数植物对低温等都是高度敏感的,低温伤害现象尤为突出,几乎涉及所有的经济植物。因此,改善植物的抗低温冻害的胁迫能力,可以显著提高植物的生长范围、增加产量。codA基因可以增加植物对低温胁迫的耐受能力,而Rd29A是一种胁迫诱导特异表达启动子,胁迫条件可以快速诱导基因表达,也可以减少由于转基因过量表达带来的不利影响。研究以麻竹花药离体培养的愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法,探讨了影响麻竹愈伤组织遗传转化效率的主要因子。结果表明,潮霉素的最佳筛选浓度是25 mg.L-1,预培养时间为3 d,侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在100 mg.L-1时可以有效的提高遗传转化效率。在此基础上对获得的转基因植株进行分子检测,初步表明外源基因codA已经整合到麻竹基因组中。     

High efficiency genetic transformation of sour orange (Citrus aurantium) and production of transgenic trees containing the coat protein gene of citrus tristeza virus

In preliminary experiments on Agrobacterium-mediated transformation of citrus, we found transformation events occurring in callus formed from the cambium. Factors affecting Agrobacterium-sour orange (Citrus aurantium L.) interactions, such as culture medium, explant source and culture conditions, were studied to assess competence for transformation in such callus and to improve transformation frequency. Cell divisions and redifferentiation from the transgenic cells leading to transformation events were stimulated more by a combination of benzylaminopurine (BAP) + naphthalene-acetic acid (NAA) in the regeneration-selection medium than by BAP alone. Both age and source of the sour orange plant material affected transformation frequency. Explants from 4-month-old seedlings grown in the greenhouse showed higher transformation frequency than younger and older plant materials, indicating that they had a more suitable balance between dedifferentiated cells competent for transformation and Agrobacterium virulence. Enhancement of transformation frequency enabled us to incorporate the coat protein gene of citrus tristeza virus (CTV) in a sufficient number of sour orange plants to be able to evaluate this strategy for producing CTV-resistant plants.     

慈竹木质素合成酶基因4CL RNAi载体构建与烟草转化

根据慈竹4-香豆酸辅酶A连接酶(Na4CL)全长cDNA序列,通过RT-PCR从慈竹幼笋cDNA中扩增约600 bp的保守片段。DNAMAN多重比对分析表明,该目标片段与3条烟草4CL基因同源性达84.08%。将目标片段插入到pSK-int中间表达载体中,获得pSK-4CL-RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pBI121中,构建该基因的shRNA表达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草(K326)。对获得的抗性再生植株的PCR检测分析初步表明该基因已插入烟草基因组中。     

Agrobacterium tumefaciens-mediated GUS gene transfer to Sophora japonica L.

Agrobacterium-mediated genetic transformation of Sophora japonica was standardized using the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 that harbored the binary vector pBI121 containing genes forβ-glucuronidase (GUS) and neomycin phos-photransterase (nptⅡ). S. japonica transformants were selected by the ability of the leaf explants to produce kanamycin-resistant calli that regenerated into kanamycin-resistant plantlets. Successful transformation was confirmed by histochemical assay for GUS activity, PCR analysis and Southern blot. The period of nearly two months was required for the regeneration of transgenic plantlets from the explants. The transformed plants resembled their parents in morphology.     

不同分布格局的梁山慈竹产量差异分析

通过对梁山慈竹的自然分布格局调查表明,梁山慈竹在川南分布较广,主要的分布形式有3种:零星独丛、数丛小片、集中成片。不同分布形式下,冠蔸面积比差异较大,其中独丛的冠蔸面积比最大。通过回归分析得出胸径和可利用秆重的回归模型为W=0.102029×D2.388139(W:可利用秆重kg,D:胸径cm)。梁山慈竹产量差异较大,通过聚类分析将梁山慈竹产量分为3类:高产、中产、低产。3种不同分布格局产量由大到小分别是数丛小片>成片>零星独丛,产生差异的主要原因是立地条件和林分密度。     

In vitro flowering of green and albino Dendrocalamus latiflorus

To propagate Dendrocalamus latiflorus, we used in vivo inflorescences to produce calli on Murashige and Skoog basal (MS) medium supplemented with 3 mg/l 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2 mg/l kinetin, 250 mg/l polyvinyl pyrrolidone (PVP), and 1% coconut milk. Multiple shoots were generated on MS medium supplemented with 0.1 mg/l thidiazuron (TDZ). The green plantlets were successfully transferred to soil. Multiple albino shoots also regenerated and were able to proliferate on medium containing cytokinins, especially TDZ. Albino multiple shoots rooted in medium containing α-naphthaleneacetic acid (NAA), and callus formation was observed in the presence of 2,4-D and picloram. Green and albino regenerates flowered after 8 months of subculture. The flowering ratio increased to 44% after three treatments in medium containing 1 mg/l TDZ. Morphological observations revealed that the in vitro green and albino flower organs were normal. However, pollen derived from the in vitro flowers of both the green and albino plants were sterile.