光皮树ISSR-PCR扩增条件和反应体系优化

以光皮树基因组DNA为材料，采用单因素实验，测试了退火温度、模板用量、dNTP浓度、Taq酶用量、Primer浓度、Buffer用量和Mg^2＋浓度等因素对ISSR-PCR的影响。优化的反应体系和条件：总体系为25μL，引物0．2μmol／L、模板20ng、Mg^2＋ 2．5mmol／L、Taq酶0．5U、dNTP为0.1mmol／L和Buffer为2.5μL。扩增程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性50s，52℃退火1min，72℃延伸1．5min，40个循环；72℃后延伸10min，1个循环。该体系的建立为今后利用ISSR进一步研究光皮树遗传连锁图谱构建、遗传多样性、种质资源鉴定和基因定位奠定了技术基础。     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

七叶树RAPD反应体系的优化

以七叶树新鲜叶片为材料,研究了七叶树RAPD分析过程中的影响因素包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合七叶树RAPD反应的PCR体系。即20μl反应体系中含有dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.8μmol/L,DNA模板50ng。扩增程序为:94℃预变性5min,然后40个循环(94℃变性30 s,33℃退火40 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10min,4℃保存。     

桉树随机引物PCR反应体系优化研究

以桉树DNA为模板,采用单因素试验方法研究dNTP浓度、Mg2＋浓度及退火温度对桉树随机引物PCR反应结果的影响。试验结果表明,最优的反应体系为：20μL的PCR反应体积中,10×Buffer2.0μL,Mg2＋（25 mmol/L）1.28μL,dNTP（10 mmol/L）0.4μL,Primer（10μmol/L）2.0μL,Taq（5 U/μL）0.2μL,DNA2.0μL;最优扩增程序：94℃预变性2 min,然后进行35个循环（94℃变性30 s,36℃退火30 s,72℃延伸2 min）,最后72℃延伸10 min。     

葡萄SSR反应体系的优化

以葡萄新鲜幼嫩叶片为材料,研究了SSR分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2 、dNTP、引物、模板DNA浓度、退火温度等,建立了适合葡萄SSR反应的PCR体系,即20μl反应体系中含有Taq酶1.0 U、Mg2 浓度为1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.5μmol/L,模板DNA20~30 ng。扩增程序为:95℃预变性4 min;95℃变性50 s、50~60℃退火1 min7、2℃延伸1 min 30 s,30个循环;最后72℃延伸7 min。     

松口蘑SRAP反应体系的优化

以松口蘑为材料,建立了松口蘑SRAP反应的优化体系。即在20μL反应体积中,模板DNA 10ng,引物浓度0．3μmol／L,dNTP 250mmol／L,MgCl 22．5mmol／L,Taq DNA聚合酶0．5U,1×Buffer;反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环：72℃延伸5min。     

香樟ISSR-PCR反应体系的正交优化

应用L9(34)正交表建立了适合于樟树ISSR-PCR的优化反应体系,即20μL ISSR反应体系中含有1×PCR buffer、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L、Mg2 2.0 mmol/L、Taq酶1 U和模板DNA50 ng.适宜的扩增条件为:94℃预变性4 min;94℃变性40 s,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,42个循环;72℃延伸10 min;4℃保存.     

松属部分种的ISSR-PCR扩增体系优化及鉴别

对松属部分种的ISSR-PCR的反应体系及扩增程序进行优化,并进行种质鉴别.优化的10 μL扩增体系为:Taq酶0.5 U,10×Buffer(Mg2+ free) ,dNTP 0.35 mmol/L,Mg2+ 2.25 mmol/L,20ng DNA ,0.8 μL引物.扩增程序为:94℃预变性7 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸2 min;最后72℃延伸7 min,4℃保温.从100条UBC系列引物中筛选出5条特异性强、稳定性好的引物UBC823、UBC840、UBC841、UBC855、UBC873,扩增的特异性条带可对松属的7个种进行鉴别.     

濒危药用植物延龄草RAPD反应体系的建立

以濒危药用植物延龄草(Trillium tschonoskiiM.)的叶片为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA进行RAPD扩增,优化了RAPD扩增反应的程序及模板、引物、dNTP、Taq酶浓度等参数。结果表明:适合延龄草的RAPD扩增程序为:94℃预变性5 min,然后执行40个循环,每个循环中94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸2 min,最后72℃延伸10min;适宜的反应体系为:25μL总体积中含DNA模板50 ng,Mg2+2.5 mM,引物0.6μM,dNTP 0.2 mM,Taq DNA聚合酶3 U。     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.