大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

结球白菜结球前期基因表达序列标签（EST）分析

以结球白菜(Brassica rapa L.ssp．pekinensis)结球前期心叶为材料，构建了结球前期球叶cDNA文库，随机挑选克隆单向单次测序后，共得到1162条峰图良好和插入片段长度大于150bp的可用序列。BLASTX及BLASTN序列比对分析表明，94．8％(1102／1162)的表达序列标签(EST)可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源类似物。同源性最大的蛋白质按物种来源分析后发现，大约77％的功能已知蛋白质来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，另外还有60个EST与已发表的植物基因没有同源性，这一部分EST对于研究结球白菜独特的生理和形态发育途径以及开展基因组分子作图具有重要的意义。同源蛋白质按其功能进行分类表明，参与蛋白质合成过程的酶或蛋白质的EST数量最多，其次是参与能量代谢过程(包括光合作用)的EST序列。在核苷酸水平上，全部EST中只有51％的同源物来自拟南芥。对上述1162条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)共获得895个非冗余片段重叠群，其中723个仅由一个EST组成(即singletons)，表明结球白菜结球过程中表达的基因种类繁多。大量EST的获得为进一步了解结球白菜结球机制及获取相关基因提供了重要的序列信息。     

玉米混合组织的EST文库的构建和部分EST序列的分析

以CLONTEECH的pDNR-LIB质粒为载体,构建了干旱和盐碱共胁迫48h和相应的无胁迫正常生长条件下耐旱玉米(ZeamaysL.)YQ7-96品系的雌雄分化期(12片叶龄)的混合组织(叶、茎和花器)EST文库。该文库容量>2×105个克隆,覆盖了预计的玉米基因组5万个基因的4倍以上。随机对3168个克隆中插入的cDNA进行测序,获得有效序列2098条,其中,2002个克隆中的cDNA进行了5'端测序,96个克隆中的cDNA的进行了5'和3'两端测序。结果表明,3'端测序的96个克隆的cDNA都含有polyA尾巴;进一步对这2098条组装分析,形成168个重叠群(Contig)和1693个单拷贝EST(Singlet),代表了共计1861条独立基因(Unigene);根据GenBank中的玉米EST数据库和BLASTn分析软件进行核苷酸同源性分析,1731条(93.01%)EST的score值大于或等于100,130条(6.99%)的EST的score值小于100,说明这130条属于新的表达基因的序列,有21条可以定位在玉米的不同染色体上;BLASTx分析表明,2098条EST中,1007条(48%)有功能注释信息,1091条(52%)无功能注释信息。该文库中的EST将会对公共数据库中现存的玉米EST数据起到补充作用。     

松树、杨树及桉树表达基因序列微卫星比对分析

微卫星是生物基因组中变异频率最快的序列,结构基因中微卫星重复数的变化会引起基因的框移突变,导致基因表达完全不同或截短的蛋白。因此在进化过程中,基因区微卫星会受到强烈选择的影响。为研究基因区微卫星在不同树种中的变化情况,在本研究中,利用SPUTNIK程序分析了NCBI数据库中松树（Pinus spp.）、杨树（Populus spp.）及桉树（Eucalyptus spp.）的表达序列标签（express sequence tag,EST）序列各3万条。结果显示,桉树和杨树EST序列含有微卫星的比例比较接近,分别为18.7%和15.3%,而在松树中则发生了较大分化,只有8.2%。研究发现,三碱基重复单元是这3个树种编码序列中微卫星的主要重复类型。除三碱基重复微卫星外,桉树和杨树EST序列中其它类型微卫星的丰度随着重复单元长度的增加而减少,而在松树中则呈相反现象。同时值得注意的是松树EST序列中变异频率快的微卫星（〉20bp）数量明显比桉树及杨树少。研究还发现,3个树种中微卫星获得或丢失重复单元的速率都随着重复单元的增加而降低。本研究首次报道了不同树种基因区微卫星比较研究,发现了一些松树与杨树、桉树相比较EST序列中所含微卫星在丰度及变异频率方面存在的异同。基因所含微卫星序列对基因的功能有重要影响,本研究的结果将为了解不同树种中基因区微卫星的特征提供重要参数,同时也将为利用所研究树种的EST序列开发多态性高的微卫星标记提供有益的生物信息学参考。     

利用EST序列鉴定葡萄应答外源赤霉素的基因

为了利用NCBI上大量的葡萄(Vitis viniferaL.)EST序列进行葡萄应答外源赤霉素基因的信息挖掘,通过本地化Blast、Blast2go等工具以及其他生物信息学工具和数据库,对NCBI上经过赤霉素(gibberellins,GA)诱导后的葡萄EST序列进行处理,获得了45条仅在赤霉素处理后表达的无冗余EST序列。Blastx注释结果显示,45条序列中有25条序列注释为假定蛋白或未知蛋白(约占55.6%),14条序列无注释信息(约占31.1%),6条序列(13.1%)注释有推定功能,其中包括整合酶蛋白(EE077049)、SPX结构域基因1(EE085000)、丝氨酸羧肽酶类44蛋白(EE091188)、CHY1(EE092187)、假尿苷合酶/转运蛋白(EE106096)、钾离子通道蛋白(EE108944)。Blast2go分析显示,共有29条序列通过基因本体论(GO)注释180个GO号,分属于分子功能(molecula rfunction)、细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)三大类的不同水平。初步推断,在外源赤霉素对葡萄进行处理后,应答基因主要具有结合活性(46.34%)和催化活性(39.02%)两方面的分子功能。其作用空间分布为整个细胞(44.68%)或者细胞器(40.43%)中,并且主要通过参与细胞生理过程(28.57%)和代谢过程(25.71%)等一系列复杂的生理生化反应完成整个应答过程。为进一步研究赤霉素处理后导致葡萄的基因表达情况提供了基本资料。     

桉树EST—PCR产物测序方案的优化

EST—PCR产物测序是EST标记开发的重要步骤。本研究利用乙醇-醋酸钠法、清洁试剂盒、虾碱磷酸酶（SAP）-核酸外切酶Ⅰ（ExoⅠ）法和凝胶回收试剂盒4种方法,对6个桉树EST-PCR产物的纯化效果和测序结果进行了比较,推荐乙醇-醋酸钠法为首选的纯化方法;利用测序试剂盒Bigdye Terminator V3．1,对1／2、1／4、1／8、1／16和1／32标准用量（8．0μL）的测序结果的分析表明,1／16和1／32用量仍可有效测序,均可作为优先的测序试剂用量。同时,也发现EST-PCR扩增谱带单一、明亮的序列与设计的目标EST具有较好的同源性,开发SNP和Indel标记的潜力极大,但较弱的谱带则可能是非特异性扩增的产物。乙醇-醋酸钠法纯化和Bigdye Terminator1／16或1／32用量的测序方案,具有成本低和操作简便的优点,适合96孔板或384孔板大规模EST—PCR产物的测序。     

基于EST-SSR标记的MCID法鉴定冬瓜种质资源

种质资源鉴定是研究与利用冬瓜种质资源的基础.为了明确冬瓜种质资源遗传多样性,本研究基于表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)分子标记的人工绘制品种鉴别示意图(MCID)法鉴定40份冬瓜种质资源.利用筛选出的7对引物对冬瓜种质资源进行PCR扩增,应用MCID法构建冬瓜品种鉴定图.结果表明,利用7对引物扩增的特征性谱...     

烟草EST数据库构建及cDNA阵列技术建立

一组容量为5 927条烟草(Nicofiana tabacum)EST的数据(GenBank登录号为CV015900～CV021826),包含521个重叠群和3 079个独立EST.EST数据分析显示:高丰度表达基因主要涉及光合代谢、蛋白合成等植物基本的生理功能;而低丰度表达基因则占假定独立转录本(TUTs)总数的85.5%.在此基础上,制备完成cDNA阵列,并应用于盐胁迫下烟叶的基因表达谱分析,结果表明,盐胁迫即可使烟草叶片的基因表达谱发生显著改变,并涉及多个重要的植物生理过程.包括水通道蛋白PIP2a、乙烯应答蛋白酶和mRNA剪接因子prp31等42个基因的检出,为阐明植物胁迫反应的调控机制提供新的线索.     

松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析

松墨天牛（Monlchamus alternatus Hope）是林业重大害虫。本研究运用SMART技术构建了松墨天牛幼虫cDNA文库,库容量为1.09×10^6,文库滴度为5.45×10^6 pfu/mL,重组率为97.8%,平均插入片段大小约为1 000 bp,构建的文库质量较好。随机选取1 022个克隆进行测序,获得了1 012条表达序列标签（ESTs）,序列在GenBank中登录号为JZ143720～JZ144731。EST序列经过聚类拼接得到411条非重复单一序列,其中216条序列有功能注释。在216条有功能注释的序列中,有181条（83.80%）参与＂分子功能＂,122条（56.48%）参与＂细胞成分＂,168条参与＂分子生物学过程＂（77.78%）。研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。     

植物EST-SSR标记开发及其应用

随着生物科技的进步,大量的植物表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）已经成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记,其多态性可能与基因功能直接相关,而且在相近植物间具有良好通用性,使得EST-SSR标记在实际应用中更具价值。采用计算机方法大规模发掘EST-SSR多态性位点极大地提高了SSR标记开发效率。尤其随着新一代测序技术的成熟以及测序成本的急剧下降,利用新一代测序技术产生大量的转录组数据进行EST-SSR多态性标记的计算机大规模发掘将对SSR标记的开发带来深远影响。本文简要介绍了植物EST-SSR分布特点,并对EST-SSR标记开发现状以及相关应用作了综合评述,此外,还对EST-SSR标记的计算机开发新策略进行了展望。     

用EST—SSR分子标记技术构建大白菜核心种质及其指纹图谱库

摘要利用EST-SSR分子标记对大白菜种质资源基因库中686份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行分析研究。构建大白菜种质资源的核心种质并且形成核心种质的EST—SSR指纹图谱库。结果表明利用4组鉴定白菜品种的EST—SSR的特异性标记组合,获得近158个EST—SSR多态的标记,对大白菜种质资源基因库中686份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行核心种质的构建提供了分析数据。形成的核心种质包括168份样品,占库存资源的8．8％,它的多态位点百分率保持了原群体的100％。所构建的核心种质涵盖了原资源的绝大部分区域来源的品种,包含了早、中、晚熟品种中所有典型的大白菜类型和其相关的特征特性。并进一步进行了核心种质资源遗传多样性分析。核心种质的EST—SSR指纹图谱库中,每一份样品的指纹都是唯一的,为登记、评价、整理、分发、繁殖等种质资源库的管理和育种者对其材料的利用提供了重要的有价值的信息。EST-SSR标记组合是构建中国大白菜核心种质及其指纹图谱的经济、高效的方法。     

银杏内生真菌多样性与产黄酮类物质真菌的分离和鉴定

采用传统组织培养法从银杏根、叶片和茎中分离内生真菌,以相对频率作为指标分析其多样性,通过显色反应、薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)等方法对内生真菌的发酵产物进行初步分析,筛选能够产黄酮类物质的内生真菌,并通过分光光度法测定总黄酮产量;同时根据菌株的形态学特征,结合真菌r DNA的居间序列(internal transcribed spacer,ITS)的系统进化分析进行菌株鉴定。结果表明:共分离得到217株内生真菌,分属于5纲、8目、10科、13属;经初步筛选,2株分离自根组织的内生真菌GF111和GF521具有产黄酮类化合物的能力,发酵液总黄酮产量分别为(14.50±1.30)mg/L和(21.10±1.30)mg/L;初步鉴定2株产黄酮内生真菌GF111和GF521分别为卷枝毛霉Mucor circinelloides和尖镰孢菌Fusarium oxysporum。可见,内生真菌在银杏不同部位在数量、种群及其组成上存在着较大差异,并且菌株GF111和GF521产黄酮能力较高,可作为生物发酵生产黄酮类物质的备选菌株。本研究为更好地开发和保护银杏资源提供了依据。     

银杏钾素营养诊断技术的研究

应用果园调查、土壤植株分析与大田钾肥施用量试验相结合的方法 ,对银杏钾素营养诊断技术进行了研究。结果表明 :土壤钾素以土壤速效钾作为诊断形态 ,其诊断指标 (mg/kg)为 :高 >75 .0 ,中 5 0 .1～ 75 .0 ,低 <5 0 . 1。银杏植株钾素营养诊断最佳诊断时期为 7月 ,最佳诊断部位为长枝条倒 8位叶。诊断形态为叶片全钾 ,其诊断指标 (% )为 :高 >0 .95 8,中 0 .81 8～ 0 .95 8,低 <0 .81 8。     

银杏幼树黄化原因的调查及矫正试验

通过果园调查、室内化验分析，以及经田间小区试验、大田验证试验，查明了银杏幼树黄化的主要原因是土壤有效养分缺乏、pH值低（酸度大）、可能存在着铝毒危害等，并提出了相应的矫正措施；合理施用NPK、石灰、有机肥、B、Zn肥料，可以有效防治银杏幼树黄化。     

氮、镁对银杏叶黄酮含量的影响

应用二元二次饱和Ｄ－最优设计进行田间试验,探讨氮、镁对银杏叶黄酮含量的影响。结果表明,在镁缺乏的红土上种植银杏,在合理施用一定的氮肥基础上,增施适量的镁肥,对银杏叶黄酮含量的提高有良好效果。计算机寻优得到供试条件银杏叶黄酮含量最佳施肥方案为：Ｎ５６０ｇ／株,Ｍｇ１５０ｇ／株,目标黄酮含量为２．４８％。     

银杏试管苗的雌雄鉴别与调控

用不同浓度的赤霉素和乙烯利调控银杏试管苗的性别分化,通过SOD、POD及酯酶同工酶和ATP含量对银杏的雌雄株进行早期鉴别。结果表明:银杏雌雄株间SOD同工酶、酯酶同工酶和ATP含量不存在差异,POD同工酶谱带有明显而稳定的差异,可作为银杏试管苗性别鉴定的指标。离体培养时,试管苗在90d时性别已分化;赤霉素和乙烯利可改变银杏试管苗雌雄株数的比例,且与激素的浓度有关,当GA3浓度为10mg.L-1时,雄株的比例最大,为86.67%,乙烯利在浓度为5 mg.L-1时雌株比例最大,达90%。     

不同介质条件对银杏淀粉糊流变特性的影响

淀粉糊流变特性是影响淀粉类食品加工品质的主要因素。该文采用布拉班德尔黏度计,考察不同介质条件如浓度、pH值、蔗糖和食盐对银杏淀粉糊黏度特性的影响。银杏淀粉糊的布拉班德尔黏度测定结果表明：随着银杏淀粉糊浓度增加,其起糊温度降低,峰值黏度增高,热稳定性、冷稳定性下降,凝沉性增强;60 g/kg银杏淀粉糊黏度性质受酸碱介质的影响较大,在pH值中性7左右,其淀粉糊黏度热稳定性最好,凝沉性最强,但冷稳定性最差;食品介质蔗糖对60 g/kg银杏淀粉糊黏度曲线影响较大,其淀粉起糊温度、峰值黏度随蔗糖浓度增加而增加,淀粉糊黏度的冷稳定性、热稳定性均降低,凝沉性增强;而食盐影响较小。该结果对银杏淀粉类食品深加工开发具有较大的指导意义。     

菠菜性别相关EST-SSR标记的开发及应用

为了明确菠菜EST序列中SSR的总体特点,开发菠菜EST-SSR引物;为利用EST-SSR引物进行菠菜性别相关特异序列的克隆奠定基础,本文从NCBI上获得1093条EST,利用在线软件SSRIT检测所含SSR序列,并进行分析。共检索出68条SSR序列,分布于64条EST中,检出率为6.22%,包括22种重复基元。其中二核苷酸重复基元的EST-SSR占主导地位,占总SSR数目的32.3%。利用在线引物设计软件Primer3.0设计了7对EST-SSR引物,在适合的PCR反应体系下,分别以雌、雄菠菜DNA基因组为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,结果显示以EST序列HS097148设计的一对引物从菠菜雌雄基因组中扩增出一条雄性特异的条带,表明通过菠菜EST-SSR引物获得菠菜性别相关特异序列是可行的。