胚胎干细胞显微注射对小鼠和猪胚胎发育影响的研究

旨在为小鼠和猪多能性干细胞嵌合体制作提供参考,探讨胚胎干细胞(Embryonic stem cells或Embryonic germ cells,ES/EG)显微注射及受体胚胎发育时期等对胚胎发育的影响。对小鼠ES细胞和猪EG细胞分别进行研究:(1)将小鼠ES细胞分别注入小鼠桑椹胚和囊胚,比较不同发育时期受体胚胎体外培养的发育率和孵化率,以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的发育率和孵化率。结果表明,显微注射后的桑椹胚体外培养发育率和孵化率分别为94.7%和70.2%,囊胚率分别为84.6%和80.8%,注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P0.01),但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P0.01);未注射胚胎(注射胚胎)的体外培养发育率和孵化率分别为96.6%(89.9%)和67.8%(75.2%),未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P0.01),但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P0.01)。(2)将猪EG细胞分别注入猪桑椹胚、早囊、囊胚及孵化囊胚,比较不同发育时期受体胚胎移植后妊娠率以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的孵化率,并对猪EG细胞显微注射针和固定针的规格进行了探讨。结果表明,显微注射的桑椹胚、早囊及囊胚移植后妊娠率为67%,而显微注射的孵化囊胚移植妊娠率为0,桑椹胚、早囊及囊胚移植后受体母猪妊娠率极显著高于孵化囊胚(P0.01),由桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植获得了两头嵌合体仔猪;显微注射和未显微注射的猪胚胎其孵化率分别为47.54%和72.97%,未注射胚胎孵化率极显著高于注射胚胎(P0.01)。确定猪EG嵌合体制作过程中,注射针外径约为30μm,内径约为25μm;固定针外直径约为130~150μm,内径约为40μm。嵌合体制作时,胚龄宜早不宜迟,桑椹胚显微注射更易操作,而且导入的时期较早,ES/EG细胞在嵌合体组织中可以有很高的贡献率,故选择桑椹胚进行注射。在本试验条件下,显微注射对小鼠胚胎发育影响不大,对猪胚胎影响较大,说明猪胚胎显微注射条件需要进一步优化。     

2i/LIF对维持小鼠胚胎干细胞多能性的研究

为了研究小分子化合物对维持小鼠胚胎干细胞(Embryo Stem Cell,ES细胞)体外培养的影响,试验使用2i/LIF培养基,包括基础培养基N2B27(Knockout DMEM/F12+N2+Neurobasal+B27+20%SR)添加1μmol/L PD0325901(FGF-MAPK通路抑制剂)和3μmol/L CHIR99021(GSK通路抑制剂)两个小分子化合物以及10 ng/m L小鼠白血病抑制因子(m LIF),以丝裂霉素C处理过的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)为饲养层培养小鼠胚胎干细胞,进而探讨该培养基对维持ES细胞多能性的影响,并进行PCR和免疫荧光检测以及体内外分化试验,为应用该培养基到大家畜多能干细胞体外培养奠定基础。结果表明:该培养条件能有效维持ES细胞的多能性。细胞具有典型小鼠胚胎干细胞的形态特征,呈碱性磷酸酶阳性,表达OCT4、KLF4、NANOG、SOX2、REX1、DNMT3B、DAPP4和CDH1多能性干细胞标志基因,表达多能性相关蛋白OCT4、SOX2、NANOG、TRA-1-60、E-cadherin和表面特异性抗原SSEA-1,具有分化成3个胚层的能力。说明已经建立了利用2i/LIF培养基维持多能干细胞体外培养的实验平台。     

小鼠8-细胞期胚胎和囊胚制备嵌合体的比较

嵌合体是指由2个或2个以上具有全能性或多能性的细胞系发育而成的复合体。随着发育生物学理论和胚胎干细胞技术的发展,将胚胎干细胞导入小鼠植入前胚胎制备嵌合体逐渐成为研究细胞分化机制的有效工具[1]。经基因修饰胚胎干细胞来源的可遗传的嵌合个体,也成为基因功能研究的重要实     

胚胎干细胞生物学特性的检测方法

本文综述了利用碱性磷酸酶（AKP）活性检测、胚胎的阶段特异性细胞表面抗原（SSEA-1）检测、Oct-4活性检测、葡萄糖磷酸异构酶（GPI）检测、染色体G带技术及其它分子标记技术等检测胚胎干细胞生物学特性的研究情况。并对胚胎干细胞的体内外分化以及在嵌合体和核移植过程中的分化情况进行了概述,具有一定的参考价值。     

小鼠的胚胎移植过程及2-细胞的冲取与培养

小鼠是现代生物学研究中应用最为广泛的实验动物，特别是随着基因工程动物的大量开发，对小鼠不同发育时期的胚胎尤其是２－细胞胚的需求量日趋增多。自５０年代人类建立了受精卵和早期胚胎的采集技术之后，很快就完成了小鼠早期胚向代母体内输卵管及子宫移植的胚胎移植技术的开发和研究。［１］。小鼠的胚胎移植技术对于实验动物学研究及生命科学研究具有重要的价值。人类用小鼠进行的各种研究，包括改良动物模型的研究、嵌合体的研究、核移植的研究、突变基因的研究、转基因动物的研究及不同试剂对冷冻胚胎的影响等都涉及胚胎体外操作的各…     

表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响

为了观察不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响,试验将小鼠原核期胚胎用链霉蛋白酶去除透明带后,分别置于含有不同浓度的表皮生长因子无血清胚胎体外培养液中培养,观察各期胚胎的发育情况.结果表明:除0.01 ng/mL表皮生长因子添加组胚胎的2细胞发育率和囊胚回收率与添加0.1 ng/mL表皮生长因子处理组差异不显著外(P>0.05),其体外胚胎各期的发育率、囊胚回收率和囊胚细胞数与其他处理组比较均差异显著(P<0.05).说明一定浓度的表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率,但是高浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎的体外发育有一定的抑制作用.     

胚胎融合制备嵌合小鼠

人工嵌合体小鼠(Chimeric mouse)是由两个不同基因型纯种小鼠胚胎融合而成的,这种小鼠各组织和器官都含有两种来源的细胞群体.人工嵌合体小鼠是研究胚胎发育、遗传、免疫机制等的具有特殊价值的动物模型,同时也为培育动物新品种开辟了一个周期短、见效快的崭新途径.本文旨在建立胚胎融合制备嵌合体小鼠的方法,为在其他动物进行细胞工程育种和转基因动物制备打下基础.     

近期干细胞研究专利

专利号主题申请者作者日期 专利类型WO985 896 3将人干细胞移植入第一和第二种动物胚胎 ,第一胚胎注入抗原 ,而第二胚胎注入源于第一胚胎的细胞 ,以大量制备人单克隆纯体。Wengler Q S Wengler Q S 1998.12 .30 A1U S5 85 1832 富集多能神经干细胞的哺乳动物神经细胞的体外培养 ,以生产分化的神经细胞。Neurospheres L td(Calgary,Alber-ta,Canada)Baetge E E,Ham-m ang JP,Reynolds B,et al1998.12 .2 2 AU S5 8495 5 3用位于重组酶靶位点两侧的永久化基因载体转化神经嵴干细胞 ,以生产永久化细胞系 ,该细胞可用于移植、制备单…     

人猪嵌合体胚胎培育成功

<正>一个国际科研小组1月26日在美国《细胞》杂志上宣布,他们把人类干细胞注入猪胚胎中,首次成功培育出人猪嵌合体胚胎,并在猪体内发育了3到4周时间。人猪嵌合体研究面临巨大的伦理争议,但科学家认为,这项工作最终有助在动物体内培育出可供移植的人类器官,从而解决移植器官来源严重不足的难题。在新研究中,人类细胞发育成了肌肉细胞和其他组织器官的前体细胞,而不是脑细胞的前体细胞。研究人员认为,人猪嵌合体胚胎将能帮助模拟认识许多人类遗传疾病的早期起病过程,并实施药物测试,最终将     

原生殖细胞生成的干细胞可形成生殖嵌合体Colin L.Stewart等

胚胎干细胞(ES)做为将目的基因导入生殖腺的新途径而引起了人们的极大兴趣,ES细胞也为哺乳动物发育的生化和分子基础提供了丰富的材料,现今所有ES细胞均来自囊胚内细胞团。从恶性畸胚瘤和性腺瘤细胞分离的胚胎瘤细胞(EC)只有极少数能形成生殖腺嵌合体。原生殖细胞(PGC)在合适的培养条件下,形成的多能细胞称EG细胞。EG细胞具有和ES及EC细胞相似的形态和发育特征,在体外分化广泛,但不清楚它们在体内能否形成体细胞系,是否具有发育的全能性和能否形成有功能的配子。