尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

枸杞叶片cDNA文库的构建

以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATractmRNAIsolationSystem分离mRNA,然后用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSystem合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装,在国内外首次构建出滴度为2 78×105pfu/mL,重组效率为88 1%的枸杞叶片cDNA文库。     

灭多威胁迫下罗非鱼精巢SSH文库的构建

[目的]应用抑制消减杂交(SSH)技术,建立灭多威胁迫下罗非鱼精巢SSH正反向文库。[方法]以雄性罗非鱼为试验动物,采用抑制性消减杂交技术构建罗非鱼精巢组织在灭多威胁迫下的正反向SSH文库。试验共获得45条EST,成功注释25条,其中正向文库13条,反向文库12条。功能明确基因按功能可分为5类,其中催化活性、细胞相关基因表达上调,细胞过程、结构分子活性相关基因表达下调。整合素β1表达量上调,丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3、Ca~(2+)-ATPase、Na~+-K~+-ATPase、核糖体蛋白L22表达下调。[结论]研究结果可为揭示灭多威对罗非鱼生殖毒性的分子机制奠定基础。     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料。采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN；用磁珠法分离得到纯化的mRNA；在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA；经与质料载体重组和转化大肠杆菌。成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库．经检测，文库存容量达10^6组率为88．21％．测序结果表明：克隆片段长度一般都大于600bp。说明构建的文库质量较高，能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要．为进一步研究奠定了．很好的物质和技术基础．     

苦豆子cDNA文库的构建

以产于新疆豆科碟形花亚科槐属植物苦豆子(Sophoraalopecuroides.L)幼苗为材料,用改进的一步抽提法提取了总RNA,再以生物素标记的Oligo(dT)为引物,经过磁性球珠法,分离出mRNA,反转录酶催化合成cD NA。与EcoRIAdaptor连接,再经SeptacrylS 400分级,磷酸化后将双链cDNA克隆于λgt11载体中,经体外包装和感染Y1090菌株,成功构建了效价为0.9×106pfu·ml-1苦豆子幼苗cDNA文库。随机挑选5个重组噬斑,PCR法检查出重组克隆的插入片段平均大于1000bp,说明cDNA文库质量较高。     

梅花鹿心脏组织cDNA文库的构建

[目的]构建梅花鹿心脏cDNA文库。[方法]提取梅花鹿心脏总RNA,纯化mRNA;合成双链cDNA,连接载体,并电转化至感受态细胞;测定文库的克隆数、重组率及插入片段大小。[结果]经鉴定,所构建梅花鹿心脏组织cDNA文库,库容量为3.8×106个克隆,重组率为100%,插入片段大小为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb。[结论]所构建cDNA文库的各项指标均达到要求。     

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料,根据SMART[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,构建了石蒜叶片全长cDNA文库.文库质量鉴定结果表明:文库滴度为1.15×106 PFU/ml,重组率99.17%,插入片段大小多为0.5～2.0 kb,1.0 kb以上的占60%.     

cDNA文库构建策略及其在盐生植物中的应用

构建各种cDNA文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法.cDNA文库主要包括cDNA全长文库、cDNA差减文库和cDNA均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同.近年来,通过构建各种cDNA文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径.旨在对cDNA文库的主要类型及其构建策略,以及cDNA文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望.     

2007-2012年中国罗非鱼无乳链球菌流行菌株血清型分析

采用PCR血清型鉴定方法,对2007-2012年从广西、广东、海南、福建和云南等地养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus中分离获得的168株无乳链球菌Streptococcus agalactiae流行菌株的血清型进行分析。结果表明：有159株为Ⅰa血清型,6株为Ⅰb血清型,3株为Ⅲ血清型。各区域流行菌株血清型也存在差异：从广西自治区7个地区50个养殖场的罗非鱼中分离的61株无乳链球菌中,有54株为Ⅰa型,4株为Ⅰb型,3株为Ⅲ型;从广东省10个地区59个养殖场的罗非鱼中分离的64株无乳链球菌中,有63株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从海南省5个地区26个养殖场的罗非鱼中分离的33株无乳链球菌中,有32株为Ⅰa型,1株为Ⅰb型;从福建省漳州6个养殖场的罗非鱼中分离的6株和从云南省文山4个养殖场的罗非鱼中分离的4株均为Ⅰa型。研究表明,2007-2012年中国罗非鱼链球菌病流行菌株血清型存在Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3种血清型,Ⅰa型为主要血清型,研究结果可为准确分析中国罗非鱼链球菌病流行规律和特点提供数据,为该病防治及疫苗候选菌株筛选提供理论基础。     

尼罗罗非鱼幼鱼氮收支与饲料组成关系

用生物学方法测定和比较了三种饲料喂养的\"吉富\"品系尼罗罗非鱼的氮收支,同时用化学方法估算和比较了三种饲料组的含氮排泄废物。结果表明,饲料种类对尼罗罗非鱼的特定生长率及饲料转化效率有显著影响(P<0.01),饲喂欧洲料的鱼的特定生长率最快;饲料种类对尼罗罗非鱼的氮收支分配也有显著影响(P<0.01),饲喂大江料的鱼用于生长的氮的比例最高;饲料蛋白源的质量、含能量以及营养平衡状况直接影响鱼的氮代谢,提高饲料质量是从源头控制养殖污染的关键。     

尼罗罗非鱼选育三代效果评价

报道了以尼罗罗非鱼吉富品系为基础群体,使用混合选择方法进行选育所产生的选育系F3的选育效果及其评价。在青岛、广州及蚌埠三个试验场,F3的日增重率分别比对照系的日增重率提高14．1％、7．5％和80．8％,平均每代选育效应为4．7％、2．5％和26．9％。选育系体侧、尾部条纹更清晰,形态特征更加符合尼罗罗非鱼标准,体重变异系数显著降低,表明有较大纯化。尼罗罗非鱼在三个试验点的选育都有生长的效果,但三地差异较大,尤其是蚌埠试验场选育系日增重率和选育效应比其它2个试验场的高出甚多,这启示我们在选育过程中要重视遗传因子－环境因子的互作的研究。     

尼罗罗非鱼Dmrt1基因克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用。参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物．扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因．并对扩增产物进行了亚克隆与测序。结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段．长度为140bp．序列无性别差异。序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrt1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78％：编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89％．充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性。进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT—PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究。结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用。     

尼罗罗非鱼8个养殖群体遗传差异的微卫星分析

利用18对微卫星引物对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)国内外8个养殖群体进行遗传差异分析.结果表明:(1)8个群体的平均等位基因数(Na)为3.61～5.11,平均有效等位基因数(Ne)为2.81～3.76,平均观察杂合度(Ho)为0.861 1～0.925 0,平均期望杂合度(He)为0.603 9～0.697 7,平均多态信息含量(PIC)为0.522 9～0.637 3.表明这8个养殖群体具有丰富的遗传变异.(2)在对8个群体的遗传距离和遗传相似度进行估算基础上所作聚类分析表明, 8个群体分为两大支,3个"吉富"群体明显聚为一支,其他5个群体聚为一支, 反映了这8个群体的亲缘关系.(3)微卫星引物UNH187可以初步作为区分"新吉富"尼罗罗非鱼和其他尼罗罗非鱼群体的特异性标记.     

尼罗罗非鱼幼鱼氮收支与饲料组成关系

用生物学方法测定和比较了三种饲料喂养的\"吉富\"品系尼罗罗非鱼的氮收支,同时用化学方法估算和比较了三种饲料组的含氮排泄废物。结果表明,饲料种类对尼罗罗非鱼的特定生长率及饲料转化效率有显著影响(P<0.01),饲喂欧洲料的鱼的特定生长率最快;饲料种类对尼罗罗非鱼的氮收支分配也有显著影响(P<0.01),饲喂大江料的鱼用于生长的氮的比例最高;饲料蛋白源的质量、含能量以及营养平衡状况直接影响鱼的氮代谢,提高饲料质量是从源头控制养殖污染的关键。     

4个罗非鱼群体遗传多样性的RAPD分析

采用50个随机引物对奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）和3个尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）群体即无锡品系、埃及品系和吉富品系进行RAPD分析,共筛选出13个重复性好的引物,其中引物S1255扩增的2500bp片段具有群体特异性,可作为区分奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的分子标记;用PopGen1．32软件进行遗传多样性分析,结果表明：奥利亚罗非鱼、无锡品系、埃及品系和吉富品系罗非鱼群体内的多态位点率分别为22．03％、52．54％、58．47％、62．71％,基因多样性指数分别为0．0912、0．2166、0．2448、0．2705,Shannon信息指数分别为0．1323、0．3136、0．3537、0．3881。无锡品系、埃及品系和吉富品系罗非鱼群体内遗传相似性指数分别为0．8194、0．7886和0．7704,遗传变异水平较高,遗传多样性丰富。奥利亚罗非鱼的群体内遗传相似性指数为0．9279,群体的遗传纯度高,遗传变异水平较低。无锡、埃及、吉富品系尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼之间的遗传距离分别为0．1370、0．2235,0．1986,说明奥利亚罗非鱼和埃及品系尼罗罗非鱼杂交可能产生更强的杂种优势。