水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体.突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应.携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当.免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外.这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性.     

白叶枯病菌xopXoo基因在致病性中的作用

辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv)在非寄主烟草上的过敏反应与xopX基因有关,但在白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)基因组中并未标注xopX同源基因的功能。为研究白叶枯病菌中xopX同源基因在致病性中的作用,对白叶枯病菌的xopXoo基因进行了克隆和突变,并对xopXoo突变体在非寄主烟草上的过敏反应、水稻苗期的水浸症状以及成株期的致病性和病菌生长能力进行了分析。测定结果显示,xopXoo基因突变并不改变白叶枯病菌在烟草上激发过敏反应和在水稻上产生水浸症状能力,但突变菌株在成株期水稻上的致病性和菌体生长能力显著下降。遗传互补能够恢复xopXoo突变体的致病性和菌体生长能力,表明xopXoo是白叶枯病菌的致病性基因。还对白叶枯病菌激发非寄主烟草产生过敏反应的可能基因进行了讨论。     

西瓜细菌性果斑病菌基因Aave-3192和Aave-2108的功能研究

从本实验室构建的西瓜细菌性果斑病菌菌株A13的Mini-Tn5转座子突变体库中筛选出2株致病性丧失的突变菌株166和167,亚克隆及测序结果表明,突变株166和167的Tn5插入位点基因编号分别为Aave-3192和Aave-2108。为了进一步明确这2个基因的功能,分别对这2个基因进行互补。生物学试验结果表明,互补菌株恢复对西瓜果实的致病性,且在游动性、群体感应、胞外多糖、生物膜等性状上部分恢复至野生菌株A13的水平,表明这2个基因与该病菌在西瓜上的致病性相关。     

hrcQ基因决定水稻条斑病菌在非寄主烟草上的过敏性反应和在寄主水稻上的致病性

 水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）hrcQ 基因在动植物病原细菌中高度保守。不同植物病原细菌的HrcQ蛋白因在N端有变化,推测可能与分泌的效应分子特异性有关。但水稻条斑病菌HrcQ蛋白对Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)的形成以及对效应分子的分泌性影响还不清楚。为弄清HrcQ蛋白在此方面的作用,利用同源重组方式获得了水稻条斑病菌^hrcQ基因的敲除突变体,该突变体丧失了在烟草上激发过敏性反应的能力和在水稻上的致病性。hrcQ基因与水稻细胞互作时受诱导表达。蛋白质 蛋白质互作结果显示,HrcQ可分别与Hpa1、HrcN、HrpB5和HrpB2互作。分泌性检测发现,HrcQ不通过T3SS分泌至胞外。hrcQ基因突变,影响Hpa1和HrpB2蛋白分泌。这些结果表明,HrcQ蛋白是形成Ⅲ型分泌系统的基本组分,并通过帮助Hpa1和HrpB2等T3SS效应因子的分泌,从而影响病菌在非寄主上的过敏性反应和在水稻上的致病性。这为进一步分析水稻黄单胞菌T3SS的形成和分泌机制奠定了基础。     

白叶枯病菌效应子XopN在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用

【目的】黄单胞菌细胞外泌蛋白质(Xanthomonas outer proteins, Xops)是植物病原黄单胞菌高度保守的毒性效应子或毒性辅助组分,通过细菌Ⅲ型分泌系统分泌到细菌细胞外部,然后转入植物细胞而发挥病理作用。水稻黄单胞菌水稻致病变种即水稻白叶枯病菌的标准菌株PXO99^A分泌的XopN是一种毒性效应子,通过影响寄主免疫反应而使水稻发病。但是,XopN对病菌毒性的影响是否因水稻品种的不同而异,还有待研究。【方法】利用同源双交换技术,先敲除了PXO99^A的XopN基因,获得了∆XopN突变体,又经过遗传互补,得到了回补菌株∆XopN/XopN。通过营养肉汤液体培养,测定了XopN对病菌繁殖能力的影响;根据文献选用14个水稻品种,通过接种实验,测定了PXO99^A对这些品种的毒性与XopN敲除或回补的影响;在XopN发挥毒性作用的水稻品种上,测定了隐性抗病基因OsSWEET11/xa13与显性感病基因OsSWEET11/Xa13受病菌侵染而表达的情况,分析了XopN敲除或回补的影响。【结果】在营养肉汤液体培养过程中,病菌突变体菌株∆XopN的繁殖速度明显低于野生型PXO99^A。PXO99^A、∆XopN和∆XopN/XopN接种水稻后,根据其在水稻叶片组织内的繁殖量及随后产生的白叶枯病症状的严重程度,将供试的14个水稻品种分为两种情况。一是感病程度与病菌XopN是否敲除或回补无关,这有10个水稻品种（IRBB1、IRBB3、IRBB8、IRBB10、IRBB14、IR24、IRBB203、IRBB204、IRBB205和IRBB211）,PXO99^A、∆XopN和∆XopN/XopN对它们的毒性无明显差别。二是XopN对病菌毒性发挥作用的水稻品种,包括高度感病的3个品种（IRBB208、Asominori和日本晴）和低感品种IRBB13。与PXO99^A或∆XopN/XopN相比,∆XopN对这4个水稻品种的毒性大为降低。在IRBB13上,病菌侵染对隐性抗病基因OsSWEET11/xa13在叶片内的表达发生抑制作用,这一效应与XopN的毒性功能相关。相反,日本晴显性感病基因OsSWEET11/Xa13却受病菌侵染的诱导,在叶片内的表达水平大幅度提高。IRBB208和Asominori携带OsSWEET11/Xa13同源基因,该同源基因在叶片内的表达水平也因病菌侵染而大幅提高。在这4个水稻品种上,PXO99^A和∆XopN/XopN能够诱导OsSWEET11/Xa13或其同源基因表达,但∆XopN无此作用。另外,XopN对病菌在非寄主植物烟草上诱发过敏反应有量变贡献,相比PXO99^A或∆XopN/XopN,∆XopN引起过敏反应的程度有所降低。【结论】XopN是一个有限广谱性效应子,在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用。XopN也是病菌繁殖所需要的,对病菌在非寄主植物上诱导过敏反应有一定贡献。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

日本水稻白叶枯病菌Xanthomonas campestris Pv. oryzae Ⅰ和Ⅲ群病原的专化性

在日本,把白叶枯病菌Xanthomonascampestris pv·oryzae菌系按其对各种水稻品种致病性本划分为5群,同时,将各种水稻品种也按其对各菌系的抗性分为5类,Horino和Hartin应用日本制定的日本鉴别系统鉴别了白叶枯病菌Xanthomonascampestris pv·oryzae印尼的分离菌株,发现了一个新的菌群,并将其定为VI群。从1978-1980年在Chugoku国家农业实验站进行这方面的研究,详细探索了水稻白叶枯病宿主与寄生菌的关系。本文作者报道一     

水稻珍汕97不育胞质与白叶枯病菌早期互作中的活性氧反应

 测定了珍汕97不育胞质和正常胞质的稻苗与白叶枯病菌在早期的互作反应,结果表明,互作体系刚建立时,稻叶内立即产生大量的超氧阴离子(O₂^-),从而激发超氧物歧化酶(SOD)和脂肪氧合酶(LOX)活性的增高,导致脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量的提高。当特异性菌株Ah28接种在不育系材料(亲和组合)上,上述反应的变化幅度和产生量均小于与正常胞质的组合(非亲和组合),非专化性菌株Os14对活性氧代谢的诱导作用在两种胞质之间差异不明显。这说明不育胞质对白叶枯病较低的抗性和专化性菌株的特异致病性均与较低的活性氧代谢水平有关。     

橡胶炭疽病菌致病相关突变体的筛选及表型分析

通过对实验室已获得的1 685个橡胶炭疽病菌T-DNA插入突变体的生物学及致病性测定,从中筛选出15个致病力明显减弱的突变体,并进行PCR检测。结果表明,该基因组中均含潮霉素磷酸转移酶基因片段。在PDA培养基上,其中2个突变体菌落颜色异常,6个生长速率下降,8个产孢量显著降低,2个突变体分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞,在洋葱表皮上,侵染钉形成率显著降低。     

转中国对虾抗菌肽基因水稻抗白叶枯病效应初析

抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类物质。利用农杆菌介导法将中国对虾抗菌肽基因np3和np5分别导入粳稻品种爱知旭中,PCR检测显示,T0代转np3基因和np5基因水稻植株的阳性率分别为36%和45%。RT-PCR检测T1代转基因水稻,结果表明抗菌肽基因在RNA水平上得到表达,而抗菌肽的表达对农艺性状未产生显著影响。用白叶枯病菌小种CR4分别对4个T1代转np3基因和np5基因株系进行接种,所有转基因株系均表现出比对照更高水平的抗性。为了验证抗菌肽基因的广谱抗性,进一步检测了np5转基因株系对3个菌株JS97-2、ZHE173和OS-225的抗性,发现中国对虾抗菌肽基因np5对白叶枯病菌可能具有较广谱的抗性。     

中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

 白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8a基因。将该基因导入菲律宾小种6 的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori（携有成株期抗性基因Xa17）的毒性,暗示avr/pthC8a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。     

云南高海拔粳稻区白叶枯病菌致病力差异分析

云南高海拔粳稻区白叶枯病危害日益严重,为了探明该区域白叶枯病菌致病力差异,对白叶枯病进行有效防控。利用15个水稻白叶枯病菌鉴别品种,对采集自海拔1800 m以上稻区11个水稻品种上的32份菌株进行致病力研究。结果发现,致病力最强的菌株是楚雄州的CX28-3和CX30-1,致病率为73.33%;最弱的是大理州剑川县的JC12-2,致病率为0。在高海拔粳稻区,菌株的致病力分化与采集地的海拔高度无关,却与地理距离、采集品种的推广面积有关;而菌株的致病型频率与其采集地的海拔、经纬度、采集品种的推广面积的相关性均不显著。鉴别品种毫糯扬(含新基因)、IRBB14(Xa14)、IRBB4(Xa4)和Tetep(Xa2,Xa16)对所有参试菌株表现为高抗或抗。因此,这些品种内所含的抗性基因值得在云南高原粳稻育种和生产中应用,特别是云南地方稻种毫糯扬,更应加强其新抗病基因的定位和克隆,以为品种选育提供新的抗原。     

连续交叉接种对云南高原粳稻白叶枯病菌株变异的影响

 为了探索影响高原粳稻区白叶枯病菌变异的因子,以2个云南高原粳稻区白叶枯菌株2001 2、K 1为供试菌株,在毫糯扬、金南风、滇粳优5号和合系41等不同品种组合上连续接种或连续交叉接种后分离菌株,利用高原粳稻白叶枯病菌的鉴别品种和分子检测手段,对获得的菌株的致病型及基因变异进行分析。结果显示,原始菌株2001 2与其7个获得菌系（23个菌株）的致病型都不同,其中,除获得菌系6 2的3个菌株致病力增强外,其他6个获得菌系的20个菌株致病力均减弱;而原始菌株K 1的抗感反应模式与其获得菌系6 8的7个菌株完全相同。利用IS1112、hrpF引物进行菌株PCR扩增以及UPGMA聚类分析并将相应序列测序,结果显示,供试菌株IS1112、hrpF分子谱型的遗传分簇与菌株致病型之间无一一对应关系;在基因序列上,各菌株的IS1112和hrpF的两个序列片段表现出不同的碱基变化特征。两个原始菌株接种在不同抗性品种组合上获得的菌系的致病性变异具有特殊性和不定向性。     

水稻抗病基因介导的抗白叶枯病反应中蛋白质表达谱的比较分析

采用双向电泳 质谱分析技术,比较分析了水稻在接种白叶枯病菌 （Xanthomonas oryzae pv. oryzae）1、4、8、24、72 h 后蛋白质表达谱的差异。通过比较接种白叶枯病菌和对照之间、接种不同白叶枯病菌生理小种之间的表达差异,鉴定了72个差异表达的抗病相关蛋白点,对其中部分点的蛋白质进行了电离子喷雾二级质谱学分析鉴定,确定了11个抗病反应中差异表达的蛋白质。