miR-145-5p靶向IGF1R介导AKT通路抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-145-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),每个处理3个重复,利用qRT-PCR、EdU和CCK-8方法检测增殖相关基因表达量、EdU阳性细胞数和细胞增殖活性;待猪骨骼肌卫星细胞分化后利用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色方法探究分化相关基因mRNA和蛋白水平及肌管形成情况;采用双荧光素酶试验、qRT-PCR和Western blot探究miR-145-5p对下游IGF1R和AKT通路的影响。结果显示,miR-145-5p基因在肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之(P<0.05);随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高(P<0.05)。在猪骨骼肌卫星细胞体外培养过程中,转染miR-145-5p mimi...     

miR-144-5p靶向WNT5a对山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响

旨在探究miR-144-5p靶向WNT5a对山羊颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本研究选用2岁健康雷州母山羊的卵巢颗粒细胞来过表达和抑制表达miR-144-5p及WNT5a,通过荧光定量PCR(real-time qPCR, RT-qPCR)、Western blot、双荧光素酶报告基因、CCK-8等技术来探究miR-144-5p与WNT5a对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，miR-144-5p在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于小卵泡颗粒细胞(P<0.01),WNT5a在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著低于小卵泡颗粒细胞(P<0.01);CCK-8检测发现，miR-144-5p抑制了GCs增殖，过表达miR-144-5p后，抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达极显著下调(P<0.01),促凋亡基因BAX的mRNA和蛋白表达极显著上调(P<0.01);Wnt/β-Catenin通路CTNNB1 mRNA和β-Catenin蛋白水平极显著降低(P<0.01);另外，miR-144-5p能靶向WNT5a抑制其表达。同时，CCK-8检测结果表明，WNT5a可促进...     

miR-18a通过靶向结合CTGF调控猪颗粒细胞凋亡

为探究miR-18a对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用,利用生物信息学分析、荧光素酶活性检测和体外培养颗粒细胞试验验证miR-18a对CTGF的靶向作用及其在猪颗粒细胞中对CTGF基因表达的影响,并通过流式细胞技术检测其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用。生物信息学分析结果表明,CTGF是miR-18a的潜在靶基因,荧光素酶活性检测进一步验证了miR-18a与CTGF的结合。在培养的颗粒细胞中转染miR-18a模拟物后,qRT-PCR和Western blot结果显示CTGF的mRNA和蛋白水平均显著降低,流式细胞技术检测表明miR-18a显著促进颗粒细胞的凋亡。而转染miR-18a抑制剂后,猪颗粒细胞的凋亡率显著降低,共转染miR-18a抑制剂和CTGF的干扰RNA后,颗粒细胞的凋亡率呈现回升。试验结果表明miR-18a通过靶向结合CTGF基因调控猪颗粒细胞的凋亡。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

猪流行性腹泻病毒通过miR-133c-3p/BCL2L2轴调控细胞凋亡

旨在探讨miR-133c-3p在猪流行腹泻病毒（PEDV）引起的细胞凋亡过程中所起的作用,并探讨其发挥作用的机制。以PEDV感染MARC-145细胞为模型,检测PEDV感染过程中细胞的凋亡情况以及6个与凋亡相关microRNAs的表达差异,RT-qPCR检测PEDV感染过程中与凋亡相关microRNAs的表达差异,合成miR-133c-3p的模拟物和抑制剂,转染MARC-145细胞,采用流式细胞术检测PEDV感染MARC-145细胞的凋亡情况,流式细胞术检测过表达和敲低miR-133c-3p后细胞的凋亡情况,采用生物信息学方法预测miR-133c-3p的靶基因,荧光素酶报告基因检测了miR-133c-3p和靶基因的结合情况,Western blot检测了过表达miR-133c-3p对BCL-w和PEDV蛋白表达水平的调控,用siRNA敲低BCL-w蛋白检测细胞凋亡情况。结果显示,PEDV的感染可以诱导MARC-145细胞凋亡（P<0.05）,与凋亡相关的microRNAs,如miR-133c-3p和miR-149-5p的表达上调（P<0.05;P<0.001）,miR-138-3p的表达下调（P<0.05）。其中,miR-133c-3p在病毒感染后升高了约5倍（P<0.01）。过表达miR-133c-3p后,细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;敲低miR-133c-3p后,细胞凋亡率降低（P<0.05）。用生物信息学方法预测miR-133c-3p与BCL2L2的3'UTR区域有结合位点,荧光素酶报告基因试验显示miR-133c-3p可以和BCL2L2基因靶向结合（P<0.01）,过表达miR-133c-3p后细胞内BCL-w蛋白的表达明显下调,且病毒的感染可以降低BCL-w的表达水平,敲低BCL-w后细胞凋亡率显著升高（P<0.01）。PEDV感染后可以通过上调miR-133c-3p的表达来下调BCL2L2的表达,从而促进细胞的凋亡。     

miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用

旨在探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的影响。本试验收集180日龄健康母猪的卵巢组织,每次试验取20对卵巢进行颗粒细胞的分离培养,将miR-24-3p的mimics及inhibitor转染进颗粒细胞,通过ELISA、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告试验等技术探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用。结果表明,过表达miR-24-3p可显著促进雌二醇的合成(P<0.01),并加快StAR、CYP19A1和CYP11A1的转录和翻译(P<0.05);而干扰miR-24-3p则显著抑制雌二醇的合成(P<0.05),并显著下调CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。进一步研究发现,TOP1是miR-24-3p的直接靶基因,过表达miR-24-3p可显著抑制TOP1的表达(P<0.05),干扰miR-24-3p可显著上调TOP1的表达(P<0.05)。而过表达TOP1则可减弱miR-24-3p对颗粒细胞雌二醇合成的促进作用(P<0.05)。综上所述,miR-24-3p通过靶向TOP1...     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性，预测miR-17-3p的靶基因；通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达；采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系；使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明，生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因，且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性；转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）；抑制miR-17-3p的表达后，PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）；过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）；而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明，miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。     

miR-215-5p通过靶向NCOA3基因抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化

为揭示miR-215-5p在固始鸡腹部脂肪沉积中的作用机制,本研究采用实时荧光定量PCR,分析了miR-215-5p在14周龄固始鸡8种组织和腹部前脂肪细胞分化过程的表达特征;通过miR-215-5p mimics和inhibitors转染试验,利用CCK-8、EdU、油红O染色、甘油三酯含量测定等方法,分别评价了miR-215-5p对固始鸡腹部前体脂肪细胞增殖和分化的影响。结果表明:miR-215-5p在固始鸡腹脂和皮脂等组织中高表达,在前脂肪细胞分化过程具明显时序表达特征;当转染miR-215-5p mimics后,前体脂肪细胞中增殖标志基因CDK1和PCNA表达水平极显著下降(P0.01)、细胞周期阻滞因子p21表达水平极显著升高(P0.01),EdU阳性细胞比例和前脂肪细胞总数极显著降低;同时,可显著抑制脂肪细胞分化标志基因PPARG、CEBPA、FABP4和LPL的表达,减少脂肪细胞内脂滴生成和甘油三酯含量。与此不同,miR-215-5p inhibitors转染前脂肪细胞后,在增殖和分化上获得与miR-215-5p mimics转染后相反的结果。同时,采用双荧光素酶报告基因系统,验证了mi-R-215-5p的靶基因,过表达miR-215-5p可抑制核受体辅激活因子3 (nuclear receptor coactivator 3, NCOA3)基因3′-UTR区荧光活性,而突变NCOA3基因3′-UTR区与miR-215-5p种子序列的结合位点可解除其抑制效果。上述结果证明,miR-215-5p可抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化,且在脂肪细胞分化过程中直接靶作用于NCOA3。因此,miR-215-5p是固始鸡腹部脂肪形成的一个负调控因子。     

miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化调节作用的研究

旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因；过表达miR-128-1-5p后，用qPCR检测增殖标志基因的表达，CCK-8和EdU检测细胞增殖情况；用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势；通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制；用油红O染色检测成脂能力。结果表明，KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中，过表达miR-128-1-5p后，增殖标志基因的表达量显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），细胞活力显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），新生细胞数显著减少（P<0.05）。前体脂肪细胞分化过程中，miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关；过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量（P<0.01），显著下调了KLF2蛋白的表达量（P<0.05），显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达（P<0.05或P<0.01），产生更多脂滴；抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述，miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖，在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达，促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

干扰B-Raf基因对绵羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

本研究旨在探讨编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/Threonine-Protein Kinase）的B-Raf基因对绵羊毛囊干细胞（HFSCs）增殖和凋亡的影响。将si-B-Raf转染至HFSCs，通过RT-qPCR实验技术检测B-Raf基因、Erk1/2基因和STAT3基因的表达水平，通过Western Blot实验技术检测B-Raf蛋白、Erk1/2蛋白、p-Erk1/2蛋白和STAT3蛋白的表达水平，通过EdU细胞增殖法和CCK-8细胞增殖检测法检测HFSCs的增殖情况，通过流式细胞仪检测HFSCs的凋亡情况。结果表明，si-B-Raf转染细胞后，B-Raf基因的表达量显著降低，Erk1/2基因和STAT3基因的表达量也显著降低；Western Blot实验结果表明，B-Raf蛋白、Erk1/2蛋白、p-Erk1/2蛋白和STAT3蛋白的表达水平显著降低；EdU和CCK-8结果发现细胞增殖受到抑制，细胞增殖水平显著下降；流式细胞仪检测到细胞凋亡水平显著上升。综上，干扰B-Raf基因表达显著抑制HFSCs增殖并促进其凋亡，可能是通过MAPK/Erk1/2通路进行的，研究可为...     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】 研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】 利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%~70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin,myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用双荧光素酶测定miR-495-3p与其靶基因的结合情况。【结果】 生物信息学预测结果表明,miR-495-3p的靶基因为心肌肌动蛋白α1(alpha cardiacactin 1,ACTC1),且miR-495-3p和ACTC1在1和10月龄山羊背最长肌中表达量均差异极显著(P<0.01)。miR-495-3p和ACTC1在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌6种组织中均有表达,在背最长肌中表达量较高。细胞转染结果表明,miR-495-3p mimic极显著促进miR-495-3p的表达(P<0.01),miR-495-3p inhibitor极显著抑制miR-495-3p的表达(P<0.01),说明miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor可用于后续试验。实时荧光定量PCR结果表明,过表达miR-495-3p促进骨骼肌细胞分化相关标志基因MyoG、Myf5的表达,抑制miR-495-3p则降低MyoG、Myf5基因的表达;过表达、干扰miR-495-3p对Pax7、Cyclin E基因的表达及细胞增殖活力均无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶报告结果表明,miR-495-3p与ACTC1基因存在靶向关系。【结论】 miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞的增殖无显著影响,但可通过靶向ACTC1基因促进山羊骨骼肌细胞分化。     

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将s...     

miR-188对小鼠乳腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

【目的】 探讨microRNA-188-5p （miR-188）在乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡过程中的调控作用，以期为乳腺癌相关治疗药物的研发提供理论依据。【方法】 培养小鼠乳腺癌细胞（4T1），建立4T1细胞小鼠移植瘤模型，分离肿瘤组织和瘤旁组织，用实时荧光定量PCR法检测miR-188的表达情况；在4T1细胞中分别转染miR-188的模拟物（miR-188 mimics）、模拟物对照（mimics-NC）、miR-188抑制物（miR-188 inhibitor）及抑制物对照（inhibitor-NC），不转染的细胞为空白对照（Con），用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-188的表达水平，CCK-8法检测细胞增殖能力，细胞划痕试验检测细胞的迁移率，流式细胞术检测细胞的凋亡率，Western blotting检测细胞相关凋亡蛋白的表达情况。【结果】 瘤旁组织中miR-188的相对表达量显著高于肿瘤组织（P<0.05）；细胞转染结果表明，与Con组相比，miR-188 mimics组miR-188的相对表达量显著上调（P<0.05），而miR-188 inhibitor组显著下调（P<0.05），mimics-NC、inhibitor-NC组均无显著差异（P>0.05），因此后续试验分别以mimics-NC、inhibitor-NC为miR-188 mimics、miR-188 inhibitor的对照进行分析。细胞增殖和划痕试验结果表明，与mimics-NC组相比，miR-188 mimics显著降低4T1细胞的增殖速率和迁移速率（P<0.05）；细胞凋亡试验结果显示，与mimics-NC组相比，miR-188 mimics显著促进4T1细胞凋亡（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-188 inhibitor显著抑制细胞凋亡（P<0.05）；Western blotting结果表明，miR-188 mimics显著降低基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表达水平（P<0.05），显著提高聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Bcl-2-associated X蛋白（Bax）的表达、抑制抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达（P<0.05）。【结论】 miR-188可显著抑制4T1细胞的增殖和迁移，促进4T1细胞凋亡，说明miR-188可以作为抑制乳腺癌进展和转移潜能的肿瘤调节子。     

miR-193a在MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

本试验旨在研究miR-193a在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cp BVDV)感染MDBK细胞过程中诱导细胞凋亡的分子机制。试验利用TargetScan和Microcosm Targets等生物信息学在线软件预测凋亡相关的miR-193a靶基因Bax,并利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-193a的靶基因;用过表达miR-193a的慢病毒pre-miR-193a-lv和抑制miR-193a表达的慢病毒pre-miR-193a-inhibitor-lv分别侵染MDBK细胞,48 h后收集细胞,然后用实时荧光定量PCR、Western blotting和流式细胞仪检测凋亡通路中Bax的表达水平及MDBK细胞凋亡率。结果预测并验证了miR-193a的靶基因为Bax;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-193a能直接结合到Bax 3'UTR区域中的miRNA反应位点,并极显著下调Bax的表达水平(P<0.01);流式细胞仪检测凋亡率结果显示,感染pre-miR-193a-lv慢病毒的MDBK细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。结果表明miR-193a能直接靶向凋亡通路中Bax基因,从而促进凋亡的发生。     

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞，油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响，qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况，利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示，miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少，过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低（P<0.05），而KLF4表达量极显著升高（P<0.01）；转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高（P<0.01）。荧光素酶活性试验结果显示，过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

臭参水提物通过miR-3081-3p及靶基因Ubn2对小鼠结肠癌的调控研究

为了探究臭参水提物通过miRNA对小鼠结肠癌的调控效果，试验首先采用高通量测序技术测定结肠癌模型小鼠的结肠组织中miRNA表达水平，通过GO注释分析和KEGG富集分析对差异表达miRNA进行功能预测，以筛选出的表达差异较显著且尚无相关报道的miR-3081-3p为研究对象并预测其靶基因；然后在NIH-3T3细胞中转染miR-3081-3p模拟物(mimics)并添加臭参水提物进行孵育，通过Western-blot检测其靶基因的表达水平，并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果表明：在结肠癌模型小鼠的结肠组织中共发现117个显著差异表达的miRNA,其靶基因主要富集在肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Ras、泛素化及NF-κB等信号通路中；其中miR-3081-3p在结肠癌模型小鼠中表达量显著下降54%,其靶基因Ubn2表达量显著上升(P<0.05);在NIH-3T3细胞中，臭参水提物孵育和转染miR-3081-3p模拟物(mimics)均可以提高miR-3081-3p的表达量并降低靶基因Ubn2的表达量，还可降低NIH-3T3细胞凋亡水平。说明臭参...     

猪ITGB1与mi R-181a靶向关系的验证

实验旨在探讨猪miR-181a与整合素β1(ITGB1)基因mRNA的靶向关系。通过生物信息学预测miR-181a与ITGB1-3'UTR的结合位点,人工合成猪ITGB1-3'UTR及突变型片段连接到双荧光素酶载体(psiCHECK-2)上,构建野生型(psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR)双荧光酶报告载体。培养PK15细胞分别转染miR-181amimics、negativecontrol和psiCHECK-2-WITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR,用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,qRT-PCR检测ITGB1基因mRNA表达水平,Western blot检测ITGB1蛋白表达水平。将含psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR分别与miR-181amimic共转染PK-15细胞。结果表明:psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR组的荧光素酶活性极显著低于其阴性对照组(P0.01);转染miR-181a mimics能极显著下调ITGB1基因mRNA的表达量(P0.01),显著下调ITGB1蛋白表达量(P0.05),而转染miR-181a Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,ITGB1基因mRNA和蛋白表达量差异均不显著(P0.05)。本研究成功构建了猪野生型及突变型ITGB1-3'-UTR双荧光素酶报告质粒,并证实miR-181a与猪ITGB1-3'-UTR存在靶向关系。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响,并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞,油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响,qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况,利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示,miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少,过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低(P0.05),而KLF4表达量极显著升高(P0.01);转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高(P0.01)。荧光素酶活性试验结果显示,过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

miR-18b-3p靶向SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

本实验旨在研究miR-18b-3p及其靶基因SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的作用机制。采集3日龄公羊背最长肌,培养绵羊前体脂肪细胞并进行诱导分化,采用油红O染色检测细胞分化情况;通过TargetScan预测miR-18b-3p的靶基因,通过qRT-PCR测定miR-18b-3p、靶基因SCD以及分化标志基因PPARγ、CEBPα在分化过程中的时序性表达;分别转染miR-18b-3p过表达载体(mimics)或抑制载体(inhibitor)及阴性对照至前体脂肪细胞后,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-18b-3p对SCD以及分化标志基因表达量的作用;采用双荧光素酶证明miR-18b-3p是否靶向SCD基因。结果表明:miR-18b-3p在分化过程中的表达量先上升后下降,在第6天表达量最高;SCD表达量低于阴性对照组(P0.01),PPARγ及CEBPα基因表达量均低于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量低于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积减少(P0.05);转染miR-18b-3p inhibitor后,SCD、CEBPα基因表达量均高于阴性对照组(P0.01),PPARγ基因表达量高于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量高于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积增加(P0.05);miR-18b-3p对SCD基因具有直接靶向作用。本实验首次在绵羊上证明miR-18b-3p可以通过靶向SCD抑制前体脂肪细胞分化,为绵羊选育给予分子育种技术支撑。