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为建立和优化云南松ISSR-PCR反应体系,运用正交实验分析了模板DNA、TagDNA聚合酶、引物、Mg~(2+)和dNTPs 5个因子对云南松ISSR-PCR反应的影响。结果表明:云南松ISSR-PCR 25μL反应体系中5个因子最佳水平为:DNA模板为3.6 ng、TagDNA聚合酶为2.0 U、引物浓度为0.8 mmol/L、dNTPs浓度为0.20 mmol/L、Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L。 相似文献
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以杜鹃花为试验材料,采用正交实验方法,研究模板DNA浓度、ISSR引物浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度等5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响,以建立适合杜鹃花的ISSR-PCR最佳扩增体系。结果表明:杜鹃花ISSR反应体系的最佳条件为模板DNA用量为60ng/20μL,ISSR引物浓度0.60μmol/L,dNTPs浓度0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度30U/mL,Mg2+浓度为0.6mmol/L。采用该反应体系可以从10份杜鹃花(R.simsii)基因组内扩增出稳定性高、重复性好ISSR-PCR产物。该研究为杜鹃花的遗传多样性分析、ISSR指纹图谱构建、亲缘关系鉴定等研究奠定了基础。 相似文献
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《中国南方果树》2017,(4)
为更好地将ISSR标记应用于番石榴种质研究,以"维邦2号"番石榴DNA为筛选体系试验材料,采用单因子试验对ISSR-PCR反应中Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度、DNA浓度进行了优化;选用引物UBC810对9份番石榴种质进行PCR反应,选取"南宁本地番石榴实生2号"DNA作为模板对8条ISSR引物进行PCR反应,对优化扩增体系进行验证。结果表明,番石榴20μL最适ISSR-PCR反应体系为1.0mmol/L Mg~(2+),0.25mmol/L dNTPs,0.8μmol/L引物,0.2U Taq酶,10ng的DNA(2.0μL 10×Buffer,加入适量ddH2O至20μL)。验证试验得到的扩增产物条带多态性丰富,且特异性强、重复性好。试验确立的最适ISSR-PCR反应体系适用于番石榴的ISSR分子标记。 相似文献
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现利用正交设计L16(45)探讨DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶对石榴ISSR-PCR反应体系的影响,首次应用加权平均法及百分制对正交实验结果进行评分,并应用DPS数据处理系统进行数据分析;同时对石榴ISSR-PCR最佳反应体系进行退火温度梯度试验。结果表明:适合石榴的ISSR-PCR最优反应体系(25μL)为:Mg2+1.75 mmol/L、dNTPs0.15 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 U、引物0.8 mmol/L、DNA模板20 ng;引物UBC 811的最适退火温度为51.2℃,且最适退火温度因引物而异。 相似文献
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以13个链格孢属小孢子种菌株为试材,采用正交实验设计的方法,研究Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物4个因素在4个水平上对链格孢属小孢子种的ISSR和RAPD反应体系的影响。结果表明:链格孢属小孢子种ISSR和RAPD的最佳反应体系为25μL的ISSR-PCR反应体系中,10×PCR Buffer 2.50μL,Mg2+浓度为2.50mmol/L,dNTPs浓度为0.10mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.25U;在RAPD-PCR反应体系中,10×PCR Buffer 2.50μL,Mg2+浓度为2.00mmol/L,dNTPs浓度为0.15mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.25U;在此基础上,对最佳反应体系的退火温度进行了筛选确定;在确定退火温度后,采用最佳反应体系,用ISSR引物UBC808和RAPD引物OPE07进行稳定性和通用性验证,结果表明该优化反应体系具有较好的稳定性和通用性。 相似文献
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以30个茶花品种为试材,采用5因素4水平正交实验以及单因素优化试验方法,研究Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR指纹图谱条带清晰度的影响,以进行茶花品种ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选。结果表明:茶花品种ISSR-PCR最适扩增条件为25μL反应体系中,Mg2+3.0mmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、引物0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、模板DNA 80ng以及52.1℃退火温度;试验从100个ISSR引物中筛选出12个适用引物;并对12个ISSR引物的多态性和稳定性进行了检验。 相似文献
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以大葱嫩叶为试材,采用单因素试验和正交实验探讨了Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、模板DNA以及Buffer用量对大葱ISSR-PCR扩增的影响,建立了大葱ISSR反应体系。结果表明:优化后的最佳反应体系为10μL反应体系中,10×Buffer缓冲液1.0μL,Mg~(2+)浓度为2.0mmol·L~(-1),dNTPs浓度为0.3mmol·L~(-1),引物浓度为0.65μmol·L~(-1),Taq酶1.0U,模板DNA为60ng,用灭菌的超纯水补齐体积至10μL。对大葱71份样品材料进行ISSR-PCR扩增体系的检测结果显示,该优化体系扩增的产物条带清晰,稳定性高,为大葱种质ISSR分子标记遗传结构分析提供参考依据。 相似文献
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利用正交设计L16(45)对金线莲ISSR-PCR反应体系的5因素(模板DNA、Taq酶、引物、Mg2+和dNTP)在4个水平上进行优化试验,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。结果表明:最终建立的金线莲ISSR-PCR的最佳反应体系为,在25μL的反应体系中,DNA模板为40ng、Taq酶为1.60U、引物浓度为0.80mmol/L、dNTP浓度为0.96mmol/L、Mg2+浓度为2.40mmol/L。该反应体系的建立为金线莲种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。 相似文献
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以7个彩色马蹄莲品种为研究对象,以品种Prafait DNA为模板,采用均匀设计法对影响彩色马蹄莲RAPD-PCR反应的4因素(模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度)在3个水平上进行U12(34)优化试验。结果表明:最佳的彩色马蹄莲RAPD-PCR的反应体系为:20μL体系中含有25ng的模板DNA,0.125mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mg2+,1×buffer反应缓冲液,0.55mmol/L引物,1.0U的Taq DNA聚合酶。 相似文献
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正交设计对‘红阳’猕猴桃ISSR反应体系的优化研究 总被引:1,自引:0,他引:1
以‘红阳’猕猴桃及其杂交F1代为试材,通过正交设计对ISSR-PCR扩增反应的影响因子进行优化,初步确立了适合‘红阳’猕猴桃ISSR-PCR反应体系:总体积20μL,10×PCR buffer2.0μL,Mg2+0.75 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 60 ng,引物1.25μmol/L,dNTPs 0.15mmol/L。扩增程序:94℃预变性7 min,94℃变性30 s,50~58℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环,72℃延伸7 min。引物UBC841的最佳退火温度为58.5℃。应用该优化反应体系,用UBC835对35份杂交F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化后的反应体系具有较高的稳定性。 相似文献
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正交试验设计在建立杜鹃花RAPD-PCR反应体系中的应用 总被引:9,自引:2,他引:7
利用正交试验对影响RAPD-PCR反应体系的各种因素进行研究,从而建立适合杜鹃花RAPD反应的最佳反应体系,最终选择杜鹃基因组RAPD-PCR的最佳扩增反应体系,即模板DNA 80ng、随机引物0.5μmol/L、dNTPs 1.1mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L,1.2μmol/LTag-DNA聚合酶,buffer 2μL,总反应体系20μL.试验设计的6个因子、5个水平中,Mg2 、dNTPs和引物的浓度是主要因子,其中Mg2 的浓度对试验的影响最大,dNTPs和引物浓度在较低的水平就可满足需要,高浓度并没有显著提高试验效果. 相似文献
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锥栗自然居群ISSR-PCR分析技术的建立 总被引:3,自引:0,他引:3
提取野生锥栗的基因组DNA作为ISSR-PCR模板,对反应体系中的模板用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶用量5个主要影响因素进行梯度试验,并对扩增程序中的退火温度与循环次数进行了探讨,初步确立了适合野生锥栗的ISSR-PCR分析技术体系,即25μL反应体系中,模板DNA40或50ng、Mg2+2.25mmol.L-1、dNTPs0.2mmol.L-1、引物0.2μmol.L-1、TaqDNA聚合酶1.0U;PCR扩增程序为:94℃预变性3min;然后94℃变性45s,(Tm+2~4℃)退火45s,72℃延伸2min,共32个循环;最后72℃充分延伸5min;1.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。 相似文献
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以平菇"唐平26"基因组DNA为模板,以U836为引物,比较了琼脂糖凝胶电泳和不同浓度聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳对ISSR-PCR产物的分离效果,并且采用PAGE电泳技术对影响ISSR反应体系的主要因素进行优化。结果表明:以PAGE电泳技术检测平菇ISSR-PCR产物的效果最好,最佳ISSR-PCR反应体系为,在20μL反应体系中,模板20ng,Mg2+浓度为1.5mmol·L~(-1),引物0.8μmol·L~(-1),dNTPs 200μmol·L~(-1),Taq酶1.0U,30个扩增循环。 相似文献