不同Bt杀虫蛋白通过食物链对大草蛉的影响

为了明确目前转基因抗虫植物中表达的Bt蛋白对农田重要捕食性天敌大草蛉的生态安全性，采用三级营养食物链评价体系，分别以对供试Bt蛋白Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab具有抗性的靶标害虫或不敏感的非靶标害虫作为大草蛉的猎物，研究了供试3种蛋白对大草蛉的影响。结果表明，当大草蛉以抗性棉铃虫（抗Cry1Ac或Cry2Ab）或抗性玉米螟（抗Cry1F）为猎物时，供试3种Bt蛋白通过食物链对大草蛉幼虫（4龄幼虫重量和幼虫发育至蛹历期）、蛹（化蛹率、蛹重和蛹发育历期）及成虫（羽化率、雌虫重量、雄虫重量和单雌产卵量）的生长发育及产卵量均无显著影响；同样地，当大草蛉以对3种Bt蛋白不敏感的非靶标昆虫——绿盲蝽作为猎物时，通过食物链传递的Bt蛋白对大草蛉生长发育及繁殖也无显著影响。因此，目前转基因棉花、玉米或水稻中广泛表达的Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab蛋白，通过三级营养食物链，对大草蛉生长发育及繁殖均无潜在毒性。     

Bt杀虫蛋白对棉铃虫的抗虫毒力和增效作用

用 Bt杀虫蛋白 (ICP) Cry1A汰选的棉铃虫 (H elicoverpa armigera)抗性种群和同源对照种群分别测定了 4种不同类型 Bt ICP的抗虫毒力。结果表明 :4种杀虫蛋白对对照种群的毒力顺序为 :Cry1Ac>Cry1Ac+ 1C>Cry2 A>Cry1C;对抗性种群的毒力顺序为 :Cry1Ac+ 1C>Cry1Ac>Cry2 A>Cry1C,其中Cry1Ac+ 1C表现出对抗性种群有显著的协同增效作用。采用从 Bt液体发酵上清液中提取的增效粉 ,与Cry1Ac以 1∶ 1和 1∶ 2的比例混合 ,对 Cry1Ac有显著的增效作用 ,用抗性种群测定的增效比值明显大于对照种群 ,处理 5d的增效比值大于 14d的     

荧光增白剂对Cry1Ac抗感棉铃虫围食膜的影响及增效作用

为了提高Bt的杀虫活性,运用扫描电镜、SDS-PAGE电泳和生物测定技术,研究了荧光增白剂FB28对棉铃虫Cry1Ac抗性和敏感品系围食膜的影响及对Cry1Ac杀虫蛋白的增效作用。结果表明,正常棉铃虫围食膜表面光滑致密,没有空洞和缝隙。用含1%FB28的人工饲料饲喂刚蜕皮的5龄棉铃虫幼虫2 h后,抗感棉铃虫围食膜表面均出现许多空洞,且敏感棉铃虫的空洞明显大于抗性棉铃虫;随着处理时间的延长,围食膜上的空洞逐渐变小,13 h后恢复正常。用1%FB28离体或活体处理抗、感品系棉铃虫,均可造成围食膜蛋白被降解。用1%FB28与Cry1Ac杀虫蛋白混合饲喂抗、感棉铃虫初孵幼虫,可明显提高棉铃虫的死亡率,且对抗性品系的增效作用明显大于敏感品系,对敏感和抗性品系棉铃虫的增效比分别为2.23和9.34;1%FB28还可以明显增加对抗、感品系3龄棉铃虫幼虫的生长抑制作用。     

种子生测法鉴定转Bt基因棉抗虫性

通过室内应用单粒种子生测法鉴定转Bt基因棉抗虫性,明确了单粒棉种室内生测鉴定转Bt基因棉抗虫性的最佳生测条件。将转Bt基因棉种子25℃萌动72 h后匀浆,与0.45 g饲料混匀,以2日龄棉铃虫幼虫为试虫,测定其死亡率。建立了相应的抗性标准:棉铃虫幼虫校正死亡率小于25％为中抗,处于25％-50％为抗,50％-65％为高抗,大于65％为特高抗。准确性验证表明,种子生测法同叶片生测法的结果相符,具有较好的准确性。     

Cry1Ac的绿色荧光蛋白GFP标记及其在棉铃虫幼虫中肠的定位分布

为了明确Cry1Ac蛋白在棉铃虫体内与中肠组织的相互作用,采用重叠PCR方法将Bt-cry1Ac基因和绿色荧光蛋白GFP基因融合,构建含Cry1Ac毒蛋白和绿色荧光蛋白GFP原核表达载体,并在大肠杆菌大量表达。利用荧光显微镜观察发现,表达Cry1Ac-GFP融合蛋白的大肠杆菌在蓝光激发下发出绿色荧光。将含有融合蛋白的菌液拌入人工饲料饲喂3龄棉铃虫幼虫96h,取棉铃虫幼虫中肠做冰冻切片并在荧光显微镜下观察。结果显示,取食含有Cry1Ac-GFP融合蛋白饲料的棉铃虫幼虫中肠能够发出强烈荧光。比较Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性棉铃虫幼虫中肠的发光部位,敏感棉铃虫幼虫的中肠围食膜已经消失,肠壁细胞发出强烈的荧光,而抗性棉铃虫的围食膜较健全并发出荧光。     

我国棉铃虫对Bt蛋白Cry1Ac抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种全球性的重要农业害虫,主要为害棉花、玉米和大豆等作物。长期种植单价Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）会使棉铃虫田间种群承受单一、持续的选择压力,必然会导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性发生演化。该文概述我国棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性现状、自然庇护所对棉铃虫Cry1Ac抗性演化的延缓作用以及棉铃虫对Cry1Ac抗性的遗传多样性,并对今后我国关于棉铃虫Bt抗性的治理对策进行了展望。     

棉铃虫对Cry1Ac抗性的稳定性及其对适合度的影响

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）对苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）Cry1Ac毒蛋白抗性的稳定性及其适合度变化,利用生物测定的方法研究了Cry1Ac抗性品系棉铃虫转到正常饲料饲养后的抗性衰退及再次筛选后抗性的恢复情况,并比较了敏感、抗性和抗性衰退后各品系间的适合度差异。在失去选择压的情况下,高抗品系棉铃虫对Cry1Ac的抗性迅速衰退,经过4代后抗性水平由最初的3626.67倍下降到1436.67倍;到第12代时抗性水平已低于10倍,随后品系保持较稳定的低抗水平;当重新进行抗性再筛选时,其抗性水平可快速恢复,抗性倍数快速回升,5代后恢复到1123.33倍。与敏感品系相比,高抗棉铃虫品系的适合度明显降低,相对适合度仅为0.33,但转到正常饲料连续饲养14代后,棉铃虫适合度明显上升,相对适合度为0.87,主要表现为卵孵化率和幼虫存活率等显著提高。     

V-ATPase H表达量下调增强棉铃虫对Cry1Ac的抗性

棉铃虫Helicoverpa armigera是世界性重要农业害虫。目前防治棉铃虫的主要手段是种植转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白的转基因作物。本文旨在研究棉铃虫V-ATPase H在Cry1Ac蛋白毒力和抗性中的作用。利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析V-ATPase H在Cry1Ac抗、感品系棉铃虫幼虫中肠及敏感品系棉铃虫幼虫受Cry1Ac诱导后的表达情况;在昆虫Sf9细胞中过表达V-ATPase H对其进行细胞定位,通过细胞毒力试验验证其对Cry1Ac毒力的影响。结果发现棉铃虫V-ATPase H基因在抗性品系中低表达,并且V-ATPase H在受到Cry1Ac诱导时也低表达;在Sf9细胞内表达V-ATPase H蛋白发现其在整个细胞中都有分布,过表达该蛋白后增强了细胞对Cry1Ac蛋白的敏感性。结果表明V-ATPase H参与Cry1Ac蛋白的毒力。     

亚洲玉米螟中肠类钙黏蛋白Cry1A毒素结合区对Cry1Ac毒素杀虫活性的影响

通过原核表达及亲和层析获得亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis中肠类钙黏蛋白Cry1A毒素结合区MPR及其在Cry1Ac抗性玉米螟中的突变体MPR-r2多肽片段。采用饲料混合法测定了MPR和MPR-r2及其分别与Cry1Ac毒素混合对亚洲玉米螟幼虫的杀虫效果。结果表明,MPR和MPR-r2多肽片段对亚洲玉米螟幼虫都有一定的杀虫作用;当MPR多肽片段与Cry1Ac毒素混合时,杀虫活性具有加性效应,而MPR-r2多肽片段与Cry1Ac毒素混合的杀虫效果则没有显著提高。     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。     

棉铃虫V-ATPase亚基B是Cry1Ac的功能受体

目前对转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）的研究发现,液泡型ATP酶（Vacuolar-type proton ATPase,V-ATPase）可能是Bt的一类新型受体。我们前期通过构建棉铃虫的中肠酵母文库筛选Cry1Ac的结合蛋白发现棉铃虫V-ATPase亚基B（V-ATPase B）可以与Cry1Ac结合。为明确V-ATPase B在Cry1Ac毒力和昆虫对Cry1Ac抗性机制中的作用,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在抗感Cry1Ac棉铃虫幼虫中及其受到Cry1Ac诱导时的基因表达情况;通过Ligand blot进一步地证实了其与Cry1Ac的结合特性;并通过在Sf9细胞中表达V-ATPase B的试验验证了其功能。结果表明V-ATPase B在抗性品系及受到Cry1Ac诱导时均下调表达,Ligand blot证实了V-ATPase B与Cry1Ac特异性结合;并且在昆虫细胞内过表达该基因,会增强Cry1Ac的细胞毒力。研究结果表明棉铃虫V-ATPase B是Cry1Ac的功能受体,并有可能通过降低基因表达来参与棉铃虫对Cry1Ac的抗性形成。     

棉铃虫围食膜中Bt抗性相关蛋白的分离与鉴定

棉铃虫是世界性的重要农业害虫。围食膜作为昆虫抵御病原微生物入侵及有害物质的第一道天然保护性屏障,其上可能存在与Bt抗性相关的受体蛋白。本研究以Bt Cry1Ac抗性和敏感品系的棉铃虫围食膜为对象,采用NuPAGE电泳技术、配体杂交、质谱鉴定和生物信息学分析等技术,测定了围食膜蛋白含量,鉴定了蛋白质的组成及与Bt Cry1Ac毒素的结合能力。结果表明敏感品系围食膜中蛋白含量为22.19%,抗性品系围食膜中蛋白含量为26.99%。抗、感品系棉铃虫围食膜上存在与Cry1Ac毒素结合的6个差异蛋白,推测其中棉铃虫羧酸酯酶蛋白和血影蛋白是2个有意义的抗性相关蛋白,2个新蛋白可能参与Bt抗性。研究证明棉铃虫围食膜上存在Bt结合蛋白且与抗性相关,为进一步明确Bt抗性机制、制定合理的Bt抗性治理策略提供了理论依据。     

转Bt基因玉米(瑞丰125、DBN9936、DBN9978)对亚洲玉米螟的抗虫效果研究

评价转Bt基因玉米对靶标生物亚洲玉米螟的杀虫作用是转基因玉米研发的重要一环。本文采用室内生测法对3种转Bt基因抗虫玉米‘瑞丰125’(表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白),‘DBN9936’‘DBN9978’(表达Cry1Ab杀虫蛋白)对亚洲玉米螟敏感品系ACB-S及抗Cry1Ab品系ACB-AbR、抗Cry1Ac品系ACB-AcR、抗Cry1F品系ACB-FR、抗Cry1Ah品系ACB-AhR、抗Cry1Ie品系ACB-IeR的杀虫活性进行测定,同时采用心叶期和抽丝期人工接虫法进行田间抗虫效果鉴定。结果表明,取食3种Bt玉米的ACB-S幼虫, 3 d死亡率100%,而取食对照常规玉米3 d存活率100%。取食3种Bt玉米的5个抗性品系幼虫除ACB-AbR和ACB-AcR有2%~6%的个体存活4~5 d, 6 d死亡率也达到了100%,其余品系均在3 d全部死亡,而取食对照玉米5~6 d的死亡率仅为4%~14%,差异显著。田间心叶期食叶级别及穗期活虫数、雌穗被害和茎秆被蛀等为害等级说明3种Bt玉米高抗亚洲玉米螟。明确了‘瑞丰125’‘DBN9936’和‘DBN9978’对亚洲玉米螟有很高的杀虫活性和田间防治效果。5个Bt蛋白抗性亚洲玉米螟品系幼虫在常规玉米上显示一定的适合度劣势。     

棉铃虫APN基因家族系统进化与功能分析

氨肽酶N（APN）是锌金属蛋白酶M1家族的成员,鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles,BBMV）细胞膜上的APN不仅在蛋白消化吸收过程中起着重要的作用,而且是Bt的重要受体蛋白。本研究通过PCR技术克隆得到7条棉铃虫APN基因全长序列,HaAPN1～7（Genbank登录号为MT002819～MT002825）。经生物信息学分析,HaAPN1～7全长为2592～3099 bp,编码863～1032个氨基酸,分子量为110～115 kDa,等电点为4.7～6.4,N端信号肽为15～20 aa。系统进化分析结果表明,HaAPN1～7分属于Class 1～7类别。RT-qPCR结果表明,在敏感棉铃虫5龄幼虫中肠中APN2的表达量最高,APN7的表达量最低;Cry1Ac抗性品系棉铃虫中各类APN的表达趋势与敏感品系一致。取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后棉铃虫中肠APN活性显著降低,取食Cry1Ac和Vip3Aa蛋白后中肠液和BBMV中APN活性都显著降低,而取食Cry2Ab蛋白后只有BBMV上APN活性显著降低;棉铃虫对Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa产生耐受性后,中肠液和BBMV中APN活性也都发生显著变化。因此,不同类别的棉铃虫APN在Bt的杀虫机制中可能起到不同的作用,APN活性变化可能与Bt蛋白的降解及抗性演化相关。     

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫的控制效果及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾生长发育的影响

为评估转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性及对非靶标害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾S.litura生长发育的影响,采用室内生测法测定其对棉铃虫的抗性及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同龄期幼虫存活率、营养代谢及中肠酶活性的影响。结果表明,转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫第2代幼虫的抗性程度最高,幼虫校正死亡率达91.33%,但对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性程度较低,幼虫校正死亡率分别为15.33%和13.33%。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾各龄期幼虫取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,其存活率与取食常规棉花对照无显著差异;甜菜夜蛾对转Cry1Ac/1Ab基因棉花叶片的相对取食量、近似消化率分别为16.68和93.12%,均高于取食常规棉花对照的10.72和92.00%,但差异不显著,而斜纹夜蛾取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后的各项营养指标均低于取食常规棉花对照,差异也不显著。取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,甜菜夜蛾的过氧化物酶活性为0.02 U/mg prot,显著低于取食常规棉花的0.05 U/mg prot;斜纹夜蛾的酸性磷酸酶活性为0.15 U/mg prot,高于取食常规棉花的0.10 U/mg prot,但差异不显著,其它中肠酶活性均低于对照,亦无显著差异。     

沉默cadherin基因对小菜蛾敏感性的影响

钙粘蛋白(cadherin)是许多鳞翅目昆虫中苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的受体。利用RNAi技术对小菜蛾中肠cadherin基因进行沉默处理,明确了cadherin基因沉默对小菜蛾对Cry1Ac毒素敏感性的影响。结果表明,注射目标dsRNA后的第1天至第5天,Cry1Ac敏感及抗性小菜蛾品系cadherin的基因表达量均显著减少,尤以第2天的减少量最为明显;Cry1Ac毒力测定结果表明,沉默cadherin基因能在一定程度上提高幼虫的成活率,即可使小菜蛾对Cry1Ac毒素的敏感性降低。研究初步表明,cadherin基因的功能与小菜蛾对Cry1Ac毒素的抗性有关。     

Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎幼虫致死效果及体内酶活性的影响

为治理小地老虎的危害,研究了Bt杀虫蛋白对小地老虎幼虫的控制作用.室内生物测定结果表明,Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎初孵幼虫的致死效果高于Cry1Ac杀虫蛋白.取食含有Cry2Ab杀虫蛋白人工饲料的小地老虎幼虫体内的中肠总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性高于对照,当人工饲料中Cry2Ab杀虫蛋白含量达到12μg/g时,小地老虎幼虫中肠氨肽酶活性显著升高;而取食含有Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的小地老虎幼虫中肠蛋白酶活性无显著变化.此外,小地老虎幼虫取食含有Cry2Ab杀虫蛋白的人工饲料后,体内谷胱甘肽-S-转移酶活性显著升高,而取食合有Cry1Ac杀虫蛋白的人工饲料后其变化不明显.     

二化螟Cry1Ac汰选品系对不同Bt蛋白的敏感性

为明确靶标害虫对Bt蛋白的抗性及对不同类型Bt蛋白的交互抗性,采用生物测定法进行了二化螟Chilo suppressalis(Walker)敏感品系和Cry1Ac汰选品系在Cry1Ac毒饲料上的时间-死亡率反应、对不同Bt杀虫蛋白的敏感性及不同Bt蛋白复配组合对二化螟毒力效果的研究。结果表明,二化螟Cry1Ac汰选品系已对36.67μg/mL(LC_(50))的Cry1Ac杀虫蛋白产生了一定的适应性,但对308.69μg/mL(LC90)的Cry1Ac蛋白反应仍较敏感。Cry1Ac敏感品系和汰选品系对Cry1Ab蛋白的LC_(50)分别为1.40μg/mL和3.86μg/mL,二者差异显著,但对Cry1Ca(1.63μg/mL和1.73μg/mL)或Cry2Aa(127.48μg/mL和144.50μg/mL)的LC_(50)差异不显著,即Cry1Ac汰选品系与Cry1Ab存在明显的交互抗性,但与Cry1Ca和Cry2Aa不存在交互抗性。在不同Bt蛋白复配组合中(1∶1复配),Cry1Ab+Cry1Ca、Cry1Ab+Cry2Aa和Cry1Ca+Cry2Aa增效作用最为显著。表明抗虫基因cry1Ca和cry2Aa可作为双价转基因抗虫水稻研发的候选基因。     

入侵云南草地贪夜蛾种群对5种常用Bt蛋白的敏感性评价

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是原分布于美洲大陆热带和亚热带地区的一种重要玉米害虫。在当地,种植抗虫转基因玉米是防控草地贪夜蛾危害的主要手段。该虫于2019年1月入侵我国云南省,为明确入侵我国云南的草地贪夜蛾种群对常用Bt蛋白的敏感性水平,本文通过饲料表面涂抹法测定了瑞丽草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab以及Vip3A等5种Bt蛋白的敏感性。结果表明:几种常用Bt蛋白对瑞丽草地贪夜蛾致死作用顺序为Vip3ACry1AbCry1FCry2AbCry1Ac,对草地贪夜蛾抑制生长发育的顺序为Cry1AbCry1FVip3ACry1AcCry2Ab。此外,与美国相对敏感种群比较,云南瑞丽草地贪夜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A的敏感性指标在0.28～3.76之间,表明该入侵种群对此5种Bt蛋白均未产生抗性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米作为防控草地贪夜蛾的技术体系提供依据。