一株黄颡鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定及其对10种中草药的敏感性研究

从湖北省某养殖场患病黄颡鱼组织中分离到1株细菌性病原,经形态学观察、16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析,鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。为确定10种中草药(诃子、五倍子、穿心莲、乌梅、连翘、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿)对黄颡鱼源维氏气单胞菌的抑菌效果,分别制备这10种中草药的水提物,使用不同浓度梯度的水提物进行了抑菌试验,并以盐酸多西环素和氟苯尼考作阳性对照。试验结果表明：诃子、五倍子、穿心莲有较好的抑菌效果,其中诃子抑菌效果最好;乌梅、连翘、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿的抑菌效果较差,其中五味子的抑菌效果最差。     

柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。     

柱状黄杆菌胶原蛋白酶的克隆与表达

利用PCR方法从柱状黄杆菌(Flavobacterium.columnare)G4株中克隆了1个胶原蛋白酶基因(GenBank登录号EF501979).同源性比对发现该基因与柱状黄杆菌的另外1种胶原酶基因(GenBank登录号EAZ95511.1)最为相近,有84%的一致性和93%的相似性.该属的另外2种细菌,约氏黄杆菌(Flavobacterium.johnsoniae)和嗜冷黄杆菌(F.psychrophilum)都有与该胶原酶基因相似的基因,其相似性分别为92%和83%.该基因经KpnI和SalI酶切后连接到表达载体pET-32a上,转人大肠杆菌BL21(DE3)plysS内进行表达,经SDS-PAGE电泳后显示重组融合蛋白在44 kD处有明显表达带,与预期分子量大小一致,且主要以不溶的包涵体形式存在,变性条件下利用His·Bind树脂成功纯化了融合蛋白,将其免疫家兔,获得兔抗柱状黄杆菌胶原蛋白酶抗体,Western blotting表明该胶原酶在柱状黄杆菌的胞内和胞外都存在.这些结果为进一步研究这种胶原蛋白酶的功能及柱状黄杆菌的致病机理奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌表达柱状黄杆菌lip基因口服疫苗对草鱼免疫保护效果的研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种水产益生菌,最近也被用作口服疫苗的投递载体。本研究利用前期筛选到的柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)保护性抗原基因lip,与pBE2R载体连接后,以质粒的方式转入枯草芽孢杆菌WB800中,构建了重组菌株WB800 (pBE2R-lip)。聚丙酰胺电泳和免疫印迹实验表明,枯草芽孢杆菌WB800 (pBE2R-lip)能表达lip蛋白,其分子量约为32 kDa。利用枯草芽孢杆菌WB800 (pBE2R-lip)口服免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)后,通过酶联免疫吸附实验,在受免草鱼血清中检测到特异性抗体效价的上升,在人工感染实验中,受免草鱼的免疫保护率为52.4%。本研究表明,利用枯草芽孢杆菌能有效表达柱状黄杆菌的lip基因,以其作为口服疫苗能引起草鱼的免疫应答并提供免疫保护效果。     

柱状黄杆菌常规PCR检测体系的建立

根据NCBI公布的柱状黄杆菌硫酸软骨素裂解酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测柱状黄杆菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,同时测试该体系的特异性和灵敏度,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的138bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为pg级,对柱状黄杆菌的检测灵敏度为25cfu/20μl。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了柱状黄杆菌常规PCR检测体系,该体系可以用于柱状黄杆菌的诊断和样品的检测。     

柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼的免疫促进作用

将柱状黄杆菌胞外多糖（EPS）溶液经腹腔注射免疫草鱼，以注射灭菌生理盐水作对照。免疫一周后，分别提取受免鱼与对照鱼肝脏、脾脏、体肾和头肾4种组织中的总RNA，并通过RTPCR半定量的方法检测不同组织中C反应蛋白（CRP）、白介素1（IL-1）、主要组织 相容性复合体I（MHC-I）、免疫球蛋白M（IgM）、干扰素（IFN）等5种免疫基因的表达情况。结果显示，CRP在受免鱼肝脏中的表达显著上升；MHC I在受免鱼脾脏、体肾中的表达显著下降；IgM在受免鱼4种组织中的表达皆显著上升；IL-1在受免鱼4种组织中的表达与对照组没有显著差异；无论受免组还是对照组都只能检测到微弱的IFN表达，且两组之间没有显著差异。结果表明，柱状黄杆菌EPS对草鱼的先天免疫能力以及特异性体液免疫能力具有促进作用。     

约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜免疫效果评价

为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和抗体效价变化规律。结果表明,约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫后,鳜肝脏Lys基因表达量显著上调(P0.05),第48小时表达量达到峰值,是对照组的10.9倍(P0.05),直到第28天表达量仍显著高于对照组(P0.05)。同时免疫鱼血清Lys活性明显升高,第2天达到峰值,是对照组的4.35倍(P0.05),第6天与对照组水平相当;免疫鳜脾脏Ig M基因相对表达量从第7天开始上调并显著高于对照组(P0.05),至第28天其相对表达量为对照组的98.7倍(P0.05);而免疫鱼血清抗体效价在第7天开始高于对照组,第28天达到峰值(26)。免疫后第28天采用强毒株M168进行攻毒,结果显示,免疫组相对成活率显著高于对照组,其相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS)达85.9%。结果表明约氏黄杆菌减毒株M170可引起鳜特异性和非特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护效果。     

柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种世界范围的水产动物致病菌,是中国重要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等烂鳃病的病原。本研究以1972年从患"烂鳃病"草鱼上分离的两株冻干柱状黄杆菌G4和G18菌株为研究对象,并将G4株再次分离纯化得纯化菌株,命名为G4R3。对草鱼鱼苗浸泡攻毒结果显示,G4R3的LD50至少比G18的高3个数量级,因此G4R3为"强毒株",G18为"弱毒株"。利用蛋白质组学方法分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,经过双向电泳并结合图像分析,共发现了34个点是差异表达的蛋白。胶内酶解、肽质量指纹图谱和串联质谱分析后,鉴定出其中的7个蛋白点,代表滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和一种可能的膜蛋白等3种蛋白,它们可能是柱状黄杆菌的毒力因子。     

柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游调控序列分析

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene,acs)的编码序列及其上游调控序列,该基因全长2 323 bp,编码635个氨基酸。通过序列分析,发现在该基因起始密码子ATG的上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site,RBS)序列TAAAA,和启动子–7和–33的保守基序TATTTTCG和TTG。将acs的上游调控序列(promoter sequence,Pacs)置于氯霉素抗性基因(chloramphenicol acetyltransferase,cat)的上游并导入柱状黄杆菌G4株后,cat基因得以表达,并使宿主细胞产生稳定的氯霉素抗性。通过5′RACE技术,确定了外源的cat基因和内源的acs基因的转录起始位点都是位于起始密码子上游46 bp处的T。通过删减分析调控序列Pacs,发现起...     

罗非鱼肠道益生菌的筛选、鉴定及其抑菌性能研究

采用“先筛选后分离”方式对活体罗非鱼肠道菌进行分离,选取革兰氏阳性接触酶阴性的细菌,反复冻融法制备模板DNA,PCR扩增并测定了菌株的16S rDNA序列,得到1株乳酸乳球菌、1株德氏乳杆菌.采用牛津杯法测定其对病原菌的抑菌效果,结果表明,这2株乳酸菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制作用,为生态养鱼提供了发酵菌种.     

黄颡鱼源温和气单胞菌的分离鉴定及中草药体外抑菌效果研究

为探明遵义金鼎镇合江源养殖场患病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的致病原因,通过对患有腹水、鳍条充血和游动缓慢等症状的黄颡鱼进行了病原菌分离纯化,得到纯培养菌株MLT-1,经过回归感染证实其为黄颡鱼的致病菌,经生理生化和16S rDNA鉴定为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时采用乙醇提取法获得30种中草药醇提物,固体培养基打孔测试中药醇提物对MLT-1的抑菌作用,结果显示：诃子、大黄、烟叶、樟叶、桑白皮5种中草药对MLT-1的抑菌效果较好,诃子和大黄的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)均为0.49 mg/mL,烟叶的MIC和MBC均为0.98 mg/mL,樟叶和桑白皮抑杀温和气单胞菌效果相同,MIC和MBC分别为0.195 mg/mL和3.91 mg/mL。结果表明诃子、大黄、烟叶、樟叶、桑白皮5种中草药可用于防治黄颡鱼温和气单胞菌细菌病。     

草鱼肠道约氏不动杆菌的分离鉴定及药敏特性研究

研究草鱼肠道不动杆菌,为鱼类肠道细菌的分离鉴定与微生态机制研究积累资料。从草鱼肠道中分离纯化获得1株细菌,编号为SW-2,采用细菌形态观察、生理生化特性分析、16S rDNA克隆测序及系统发育树构建等进行研究。结果表明SW-2菌株为革兰氏阴性短杆菌,对葡萄糖、甘露糖、木糖、枸椽酸盐利用等均为阴性;PCR方法扩增SW-2菌株16S rDNA并亚克隆至pMD18-T载体,测序获得序列长度为1 503 bp,与约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)序列相似性最高为99.7%;进一步构建系统发育树显示与A.johnsonii亲缘关系最近,自然聚类为一支,从而确定为约氏不动杆菌(A.johnsonii);药敏试验结果显示SW-2菌株对庆大霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素等药物敏感。人工回归感染草鱼7 d后未出现发病死亡现象,但是否为条件致病菌有待进一步研究。     

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及定居因子抗原基因检测

2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。     

MiR-155靶向踝蛋白调控柱状黄杆菌胞外多糖诱导的EPC细胞凋亡

柱状黄杆菌胞外多糖 (FC-EPS) 孵育能显著提高鲤上皮瘤细胞 (EPC) 中 miR-155 的表达,导致细胞发生凋亡。为研究 miR-155 在 FC-EPS 诱导的细胞凋亡中的作用机制,本文采用 RNAi 技术,通过过表达 miR-155 和敲降踝蛋白 (talin-1),皆能抑制 FC-EPS 诱导的细胞凋亡,并鉴定出 talin-1 为 miR-155 的靶蛋白。在 FC-EPS 诱导细胞凋亡的过程中,踝蛋白水平显著升高,在凋亡发生阶段检测到凋亡执行蛋白 caspase-3 的活化,同时检测到两条踝蛋白剪切异构体,大小约为200 kDa 和 250 kDa;将构建的鲤 talin-1 真核表达质粒转染 EPC 细胞,过表达的 talin-1 延迟且延长了细胞凋亡的进程,并检测到上述两条踝蛋白异构体。然而,当以 FC-EPS 转染 EPC 细胞时,talin-1 先下降再恢复到正常水平,细胞不发生凋亡。因此,在 FC-EPS 诱导细胞凋亡的过程中,细胞通过上调 miR-155 来调控靶基因 talin-1 mRNA 和蛋白转录的变化,以及产生 talin-1 蛋白异构体来抑制细胞发生凋亡。本文为有效防治柱状黄杆菌疾病提供新思路。     

中西药联用对柱状黄杆菌体外抑菌作用研究

为研究中西药复方制剂对柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)的抑菌效果,采用水煎煮法提取五倍子、黄芩等12种中草药的活性成分,首先采用纸片法测定15种药物中西药单方制剂的抑菌效果,然后使用二倍稀释法测定具有抑菌效果药物的最小抑菌浓度,最后使用采用棋盘交叉法测定中西药复方制剂的协同作用。结果表明,氟苯尼考和黄芩联用形成的复方制剂对柱状黄杆菌具有协较好的抑菌作用。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。     

大黄、虎杖不同部位对嗜水气单胞菌和柱状屈桡杆菌抑菌效果比较研究

研究了大黄、虎杖不同部位的提取物以及各部位之间两两联用时抑制嗜水气单胞菌和柱状屈桡杆菌的效果。抑菌效果是大黄的乙酸乙酯萃取部位>水溶性部位>乙醚萃取部位>石油醚萃取部位;虎杖的乙醚萃取部位>乙酸乙酯萃取部位>水溶性部位>石油醚萃取部位;两两联用时,虎杖和大黄的乙酸乙酯部位活性成份联用、水溶性部位成份联用具有明显的协同作用。     

齐尔白鲑源嗜麦芽寡养单胞菌分离及16S rRNA基因鉴定

从发病齐尔白鲑(Coregonus nasus Pallas)的肾脏组织中分离到了1株优势菌QEBG-001,将分离纯化的菌株进行形态、生理生化特征研究和16S rRNA基因鉴定分析。结果显示,QEBG-001菌株的形态和生理生化反应结果符合嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的特征;16S rRNA基因序列分析结果显示,分离菌株在系统发育树上与嗜麦芽寡养单胞菌属同一分支,相似性达98%以上。综合菌株QEBG-001的形态学、生理生化试验及16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌。药敏试验结果表明,分离菌株对利福平、美福仙(头孢西丁)、左氧氟沙星、氟苯尼考敏感性高。研究结果对养殖生产中用药预防和治疗被嗜麦芽寡养单胞菌感染的齐尔白鲑有实际指导意义。     

一株猪源约翰氏不动杆菌的分离鉴定

于病死猪肺脏中分离得到一株约翰氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)革兰氏染色结果呈阴性棒状杆菌。通过PCR检测方法检测分离株16S rDNA基因序列,经BLAST比对后确定该菌为约翰氏不动杆菌。该菌对昆明鼠具有致病性,半数致死量为3.0×10~8 CFU/mL。最小抑菌浓度(MIC)试验结果中该分离株对氨苄西林、庆大霉素、四环素、氟苯尼考呈耐药。