口蹄疫抗原决定簇融合基因转化拟南芥初步研究

利用根癌农杆菌介导法将携带有0型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21-O14-A21的双元表达载体对拟南芥外植体进行遗传转化,并探讨了不同侵染时间和菌液浓度对农杆菌遗传转化效率的影响.通过潮霉素筛选,共获得522块抗性愈伤组织,经再生培养得到36棵再生苗,对部分再生植株进行PCR检测,结果表明目的基因已整合到拟南芥基因组中.     

根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化的一些影响因素

对根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化过程中涉及的外植体选择、预培养、共培养时间等因素进行优化。结果表明,马铃薯的茎段和叶片均能诱导出愈伤组织并分化成苗;在转化前对外植体预培养2d,再用OD600为0.5的农杆菌菌液侵染10min,共培养3d,转化效率较高。利用优化的农杆菌介导法进行转化,对再生苗进行PCR检测,结果表明,特异切割马铃薯纺锤块茎类病毒的核酶基因已导入了马铃薯。     

根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

天山雪莲遗传转化体系建立

采用根癌农杆菌介导法进行GFP基因的遗传转化,建立了农杆菌介导天山雪莲遗传转化体系。以天山雪莲胚性愈伤组织为受体;40 mg/L的卡那霉素为胚性愈伤组织筛选质量浓度;胚性愈伤组织预培养2 d后用含100μmol/L AS和500 mg/L脯氨酸的感染工程菌液侵染25 min,能够取得比较理想的转化效果。对8株卡那霉素抗性植株进行PCR及GFP荧光蛋白检测,共获得6株阳性植株。结果表明GFP基因已整合到天山雪莲的基因组中并得到表达。     

小细胞团为受体的根癌农杆菌介导的非洲菊基因转化体系

以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为起始材料,通过匀浆将其切割成小细胞团,再利用该小细胞团为外植体进行农杆菌介导的GUS基因转化.标记基因GUS的转化及转化愈伤组织的X-Gluc染色证明了该方法可以高频率地(＞80%)获得转化愈伤组织;通过对转化愈伤组织的再生培养,获得了8株X-Gluc染色阳性植株;转化植株的PCR检测和Southern分子杂交检测进一步表明,目的基因已整合入非洲菊基因组中.     

小细胞团为受体的根癌农杆菌介导的非洲菊基因转化体系

以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为起始材料,通过匀浆将其切割成小细胞团,再利用该小细胞团为外植体进行农杆菌介导的GUS基因转化。标记基因GUS的转化及转化愈伤组织的X-Gluc染色证明了该方法可以高频率地（〉80％）获得转化愈伤组织;通过对转化愈伤组织的再生培养,获得了8株X-Gluc染色阳性植株;转化植株的PCR检测和Southern分子杂交检测进一步表明,目的基因已整合入非洲菊基因组中.     

农杆菌侵染条件对玉米单倍体遗传转化的影响

以玉米诱导系HHI69诱导玉米自交系获得的单倍体愈伤组织为受体材料,GUS基因为报告基因,采用农杆菌介导法进行遗传转化,对影响转化效率的侵染条件进行了研究。结果表明:继代8 d后的愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染力好于LBA4404;侵染液浓度OD_(600)为0.7、侵染时间为30 min时,GUS瞬时表达率最高,达到了65.31%。     

农杆菌介导小麦HMW-Glu(5+10)基因转化研究

以含有HMW-Glu(5 10)基因的农杆菌(EHA 105)对豫麦18号幼胚愈伤组织进行了遗传转化,得到的6株转基因再生植株.经PCR初步检测,发现有2株的基因组中5亚基基因呈现阳性,其中1株的基因组5亚基和10亚基基因均呈现阳性.表明目的基因可能已经整合到了受体基因组中.同时对影响农杆菌介导遗传转化的几个重要因素进行了探讨,发现乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol.L-1、菌液OD600值为0.5、侵染时间为1 h、侵染后对愈伤组织适当干燥处理等可有效提高农杆菌的转化效率.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。     

农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化

以烟草叶片为试材,用转入植物表达载体pBI121的根癌农杆菌EHA105进行遗传转化。通过分析菌液不同浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度及共培养时间对GUS基因表达的影响,研究其瞬时表达的最佳条件。结果显示:用OD600值为0.6的农杆菌侵染6min,在培养基中添加120μmol.L-1的乙酰丁香酮,共培养2d,能够得到高效的GUS基因瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的苦瓜遗传转化

用含质粒载体pB I121的根癌农杆菌转化“南屿”苦瓜子叶节,通过对gus基因瞬时表达情况进行观测,对根癌农杆菌介导的苦瓜遗传转化体系相关因素进行研究.结果表明,苦瓜子叶节必须预培养3 d左右,用D600nm值为0.3-0.5之间的菌液浸泡,侵染时间为10 min,然后共培养3-4 d.再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到苦瓜基因组中.     

农杆菌介导法将FPFJ基因导入油菜的研究初报

将拟南芥早花基因FPF1（flowering promoting factor 1)插入双元高效表达载体pBI 121中,构建了植物表达载体pBIUbi-FPF1。以“双低”甘蓝型晚熟油菜品种2000 F4102,2000 F4153的下胚轴为转化受体,通过农杆菌介导的遗传转化获得抗卡那霉素的再生转基因植株,并探讨了影响油菜再生频率以及遗传转化效率的几个因素。对部分经卡那霉素筛选得到的再生植株进行了PCR检测,其中70％以上的卡那霉素抗性植株表现阳性,初步证明FPF1基因已整合到油菜细胞核基因组中。     

PBI121/GPAT质粒的构建及对非洲菊转化*

 为提高植物抗寒性,本文构建一个植物表达载体,并对非洲菊进行转化。用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶（GPAT）基因构建表达载体,将GPAT插入表达载体pBI121质粒取代该质粒上原有的GUS基因,并用PCR和酶切进行鉴定。用农杆菌介导的方法将该质粒转化到非洲菊中。结果表明该植物表达载体构建成功,同时对非洲菊高效转化体系进行探索,获得卡那霉素抗性苗7苗。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

农杆菌介导的 BADH—CMO 基因转化玉米愈伤组织的初步研究

植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状,将多个耐盐相关基因导入同一植物更有助于提高植物的耐盐能力.以玉米自交系H99、丹988的胚性愈伤组织为受体材料,通过愈伤组织对NaCl的敏感性试验,确定转化愈伤组织的适宜选择压,适宜愈伤组织转化的盐浓度为225 mmol/L.并对农杆菌遗传转化系统的条件进行了初步研究,用带有pCAMBIA-1301-CMO-BADH质粒的根癌农杆菌转化玉米愈伤组织,结果表明:采用EHA105的菌株振荡20h后,菌液OD值为0.5～0.6时侵染25 min为农杆菌转化的适宜条件.对移栽成活的36棵抗盐植株经PCR检测有2株呈阳性,阳性株率最高达到5.6％,初步证明目的基因已整合到玉米基因组中.     

农杆菌介导转录因子DREB1C基因转化速生型刺槐的研究

引自匈牙利的刺槐是可用于观赏、水土保持、饲料和蜂源的速生型树种，向这个树种转入耐逆基因，可满足干旱、盐碱地植被恢复的需求.该文对速生型刺槐进行了3个方面的研究:在含有不同组合6-BA和NAA的MS培养基上的芽再生情况、根癌农杆菌介导GUS（载体为pCAMBIA 1301）基因转化的优化以及耐逆转录因子基因AtDREB1C（相同载体）的转化.结果表明:①以无菌苗复叶叶轴为外植体，在附加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L的MS培养基上芽再生率最高，为77.5%；②同样的外植体在MS培养基上预培养0～2 d后, 用附加乙酰丁香酮的根癌农杆菌菌液侵染15～20 min，再接种于附加20 mg/L乙酰丁香酮和Hyg 7mg/L的上述MS培养基上，共培养2 d，可获得最佳转化效果；③用上述优化的方法将AtDREB1C导入刺槐，获得转基因植株，并得到PCR、PCRSouthern blotting和Southern blotting的验证.      

Pti5基因植物双元表达载体的构建及鉴定

Pto基因编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,对番茄细菌病具有良好抗性。Pti5是与Pto互作的蛋白质,Pti5蛋白与广泛存在的病程相关蛋白基因（PR基因）中的顺式元件相结合,可增强PR基因的表达,为提高植物抗病性提供了有效的途径。本研究将Pti5基因构建到植物双元表达载体pBI121上,获得pBI121UCH1重组质粒,并将该质粒转到根癌农杆菌LBA4404中,为植物利用根癌农杆菌转化系统转Pti5基因进行抗病基因工程育种奠定了基础。     

美洲黑杨遗传转化系统优化的研究

 研究了影响根癌农杆菌（Agrobaterium tumefaciens Conn）介导的美洲黑杨遗传转化的若干因素,建立了美洲黑杨简单、高效的遗传转化系统,获得了大量转基因植株。结果表明：外植体预培养3d,菌液浓度OD600值为0.4~0.6的农杆菌中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化系统,转化率最高时可达10.0%。同时发现选择带叶柄的叶片作为转化受体,转化频率也有明显提高且不同分化培养基的配方对美洲黑杨的转化效果也有一定影响。