不同周龄酉州乌羊幼羔超排及卵母细胞体外发育研究

选择4~8、8~12、12~16周龄羔羊进行超排处理,研究羔羊卵巢与卵泡的发育情况、卵母细胞活体采集效果及其体外发育能力。结果表明:羔羊超排处理后卵巢大小随着周龄的增加明显下降;4~8周龄组可用卵泡数、回收卵母细胞数极显著高于8~12周龄组和12~16周龄组(P0.01),但卵母细胞的回收率随着周龄的增加而升高;12~16周龄的A、B级卵母细胞所占比率较高,A、B级与C级卵母细胞的成熟率差异极显著(P0.01);对成熟卵母细胞进行体外受精,C级卵母细胞卵裂率显著低于A级与B级卵母细胞(P0.05);酉州乌羊幼羔体外胚胎移植妊娠率为27.03%,生产羔羊14只。结果提示,4~8周龄酉州乌羊羔羊超排效果优于8~12、12~16周龄段羔羊,活体采集的羔羊卵母细胞可经体外成熟、体外受精和胚胎移植获得后代。     

幼龄羊的周龄及卵母细胞体外培养体系对JIVET技术的影响

为了探讨周龄及卵母细胞体外培养体系对幼龄羊胚胎体外生产技术(JIVET)的影响,试验对10只5~10周龄杜寒杂种羔羊进行激素诱导,获取卵母细胞,分别在基础成熟液和含200μmol/L半胱氨酸的成熟液里成熟,再分别在含2%发情羊血清(ESS)的Ⅰ受精液和含3 mg/m L牛血清白蛋白(BSA)的Ⅱ受精液里受精,测定不同周龄羔羊的采卵数量、卵母细胞成熟率和卵裂率。结果表明:5,7,8,10周龄羔羊获得卵母细胞数分别为(111.00±16.97)枚/只、(139.50±28.99)枚/只、(108.50±17.68)枚/只、(42.00±11.31)枚/只,5,7,8周龄羔羊显著高于10周龄羔羊(P0.05),而5,7,8周龄羔羊之间差异不显著(P0.05);试验成熟液获得的卵母细胞成熟率比基础成熟液高3.64百分点;Ⅰ受精液获得的卵母细胞卵裂率极显著高于Ⅱ受精液(P0.01)。说明选择5~8周龄羔羊、卵母细胞体外成熟液添加一定量半胱氨酸和体外受精液含一定量ESS可以改善JIVET体系。     

不同品种绵羔羊超数排卵及胚胎体外生产技术研究

探讨品种对羔羊超数排卵效果和卵母细胞发育能力的影响,并将体外受精胚胎进行了移植,为研究利用绵羊羔羊卵母细胞生产后代提供理论和技术方法。对4～8周龄不同品种羔羊用FSH+PSMG处理后获得的平均卵母细胞数量和体外胚胎卵裂率和囊胚率进行了比较,并比较成熟液中有无β-巯基乙醇对胚胎卵裂率和囊胚率的影响。结果:各品种获得的平均卵母细胞数分别为:哈萨克为210.22枚,湖羊为0枚,美利奴为135.80枚,湖羊与哈萨克的杂交后代为37.80枚,湖羊羔羊和湖羊与哈萨克羊的杂交羔羊获得的平均卵母细胞数显著低于哈萨克羔羊(P<0.01,P<0.05)。哈萨克羔羊卵裂率(69.0%)显著高于湖羊与哈萨克羊杂交羔羊(66.4%,P<0.05);哈萨克羔羊囊胚率(17.5%)和美利奴羔羊囊胚率(16.2%)显著高于湖羊×哈萨克羔羊(13.8%)(P<0.01,P<0.05)。β-巯基乙醇对羔羊胚胎卵裂率影响不显著,对囊胚率影响极显著(P<0.01)。哈萨克羔羊卵子体外受精获得的2-8细胞胚胎进行输卵管移植,14只受体羊中7只妊娠,妊娠率为50.0%;共产羔9只,其中8只存活。     

冷冻保存能降低绵羊卵母细胞受精能力

本实验研究了体外成熟绵羊卵母细胞在舍抗冻保护荆DMS()和EG的冷冻液中暴露和OPS法玻璃化冷冻保存后对体外受精卵裂率、精子入卵率、皮质颗粒分布、酶溶解透明带时间及雌原核形成的影响.将体外成熟24 h的绵羊卵母细胞分为3组:(1)对照组,卵母细胞不进行处理;(2)毒性组,卵母细胞在冷冻液中进行暴露但不投入液氮中冷冻;(3)冷冻组,卵母细胞利用OPS法进行玻璃化冷冻.处理组卵母细胞在浓度递减的蔗糖溶液中脱除抗冻保护剂.结果,卵母细胞体外受精的卵裂率和单精子入卵率,毒性组(62.3%和29.3%)和冷冻组(67.6%和28.2%)显著低于对照组(78.4%和45.0%)(P＜0.05),毒性组和冷冻组间无显著差异(P＞0.05).为了研究冷冻保存导致卵母细胞受精能力降低的机制,处理组及对照组一部份卵母细胞分别于处理后0 h(IVM24 h)、2 h(IVM26 h)和体外受精后12 h(IVFl2 h)测定皮质颗粒分布和用0.1%链霉蛋白酶溶解透明带时间,另一部份卵母细胞则在不含有精子的受精液中孵育12 h后测定雌原核形成率.结果,在IVM24 h和IVM26 h,皮质颗粒呈完全释放的比例,毒性组(41.2%和40.8%)和冷冻组(41.7%和51.8%)显著性高于对照组(7.1%和18.4%)(P＜0.05);IVM26 h酶溶解透明带时间,毒性组(435.6±16.6)s和冷冻组(422.3±14.6)s显著长于对照组(381.6±15.3) s(P＜0.05);雌原核形成率,毒性组(58.7%)和冷冻组(63.9%)组显著高于对照组(8.2%)(P＜0.05).上述结果表明,舍DMS()和EG的冷冻液对体外成熟绵羊卵母细胞具有孤雌激活作用,引起皮质颗粒的提前释放,导致透明带变硬,降低卵母细胞的受精能力.     

绵羊体外成熟卵母细胞OPS法玻璃化冷冻保存试验

研究以EDFS30为玻璃化冷冻液,以卵母细胞解冻后孤雌激活和体外受精后的卵裂率、囊胚发育率作为评价指标,探讨了以OPS法玻璃化冷冻保存体外成熟绵羊卵母细胞的效果。结果表明:卵母细胞孤雌激活后的卵裂率,冷冻组(64.2%)显著(P<0.05)低于毒性组(76.7%)和对照组(79.1%),而毒性组和对照组无显著(P>0.05)差异;卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率,冷冻组(4.2%)和毒性组(5.8%)均显著(P<0.05)低于对照组(20.2%),毒性组和冷冻组无显著(P>0.05)差异;冷冻组和毒性试验组卵母细胞体外受精后的卵裂率和囊胚发育率(67.6%和7.1%;62.3%和9.1%)均显著低于对照组(78.4%和28.4%)(P<0.05),而毒性组和冷冻组无显著(P>0.05)差异。可见以EDFS30为玻璃化冷冻液,采用OPS法冷冻保存绵羊体外成熟卵母细胞会在一定程度上降低其受精能力和胚胎发育能力。     

冷冻后小鼠卵母细胞的透明带和质膜对体外受精的影响

以冷冻保存后的小鼠卵母细胞为实验材料,研究其膜对体外受精效果的影响。在室温(25±0.5)℃条件下,以10%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)为预处理液,EDFS30为玻璃化溶液。将卵母细胞于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30s,然后再移入EDFS30中处理25s,以开放式拉长细管(OPS)为承载器投入液氮中,即两步法玻璃化冷冻保存。结果表明:冷冻卵母细胞受精后的卵裂率(46.67%)显著低于新鲜组的(86.06%)(P<0.05)。冷冻卵母细胞去透明带后质膜上的平均精子结合数(10.70)与对照组(10.81)无显著性差异(P>0.05),形成雌雄原核数也无显著性差异(2.49vs.2.59)(P>0.05)。冷冻卵母细胞透明带打孔后,其体外受精后卵裂率与新鲜组差异不显著(84.73%vs.91.19%)(P>0.05)。因此玻璃化冷冻保存小鼠卵母细胞透明带的变化是影响体外受精效果的主要因素之一。     

奶牛GV期卵母细胞OPS法和GMP法超低温冷冻效果

采用OPS管和GMP管对GV期的牛的卵母细胞进行玻璃化冷冻.在不同的前处理液中平衡5 min,然后在冷冻液(EFS30,EFS40,EDFS30或EDFS40)中平衡30 s,进行OPS法和GMP法玻璃化冷冻保存.结果显示,OPS法用EFS40液和EDFS40液冷冻后形态正常卵率为69.6%和76.1%,2组差异显著(P<0.05),成熟率最高达19.2%和33.3%,2组差异显著(P<0.05);GMP法用EFS40液和EDFS40液冷冻后形态正常卵率最高达75.6%和80.8%,2组差异显著(P<0.05),成熟率最高达15.6%和34.9%,2组差异显著(P<0.05).而采用EDFS40液,OPS法和GMP法对GV期卵母细胞体外发育的影响差异均不显著,但GMP法的冷冻效率较高.表明采用EDFS40液GMP法对GV期卵母细胞的冷冻效率优于OPS法.     

羔羊卵泡诱导发育、活体采卵和体外发育潜能研究

本研究旨在探讨聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone,PVP)作为缓释剂在羔羊卵泡诱导发育中的应用效果,以及品种、年龄、激素剂量和超排次数对活体采集卵母细胞数量和体外发育能力的影响。选用4~12周龄无角道塞特、萨福克母羔120只,分为15%PVP一次肌注组、30%PVP一次肌注组和常规递减注射组,每组40只,注射剂量均为120 IU,对30%PVP一次肌注组按品种、周龄、激素剂量和重复次数分为3~4小组,分别进行卵泡诱导发育和活体采卵,并与屠宰厂采集的卵母细胞对比进行体外受精和胚胎移植。结果表明,采用30%PVP缓释FSH进行羔羊超排,可以起到与常规超排一致的效果,二者差异不显著(P>0.05),但采用15%PVP缓释FSH进行羔羊超排没有取得理想的效果,在各项指标上均显著低于30%PVP组和常规递减注射组(P<0.05);采用30%PVP缓释FSH分别超排道塞特和萨福克羔羊,只均获卵数和可用卵数差异不显著(P>0.05),4、6和8周龄羔羊只均获卵数和可用卵数显著高于12周龄羔羊组(P<0.05),40 IU组只均获卵数显著低于80、120和240 IU剂量组(P<0.05),240 I...     

不同浓度紫杉醇预处理对绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响

细胞骨架系统的稳定对于提高卵母细胞或胚胎冷冻后的存活率及其发育能力具有重要作用。紫杉醇(Taxol)作为细胞骨架稳定剂,可增强α、β-微管蛋白二聚体的紧密联系,增大微管交联,促进微管聚合和稳定。本实验以绵羊体外成熟卵母细胞为材料,旨在探讨紫杉醇预处理对玻璃化冷冻绵羊卵母细胞存活率、形态正常率及体外受精后胚胎发育率的影响。采用0、0.5、1.0、1.5μmol/L的紫杉醇预处理绵羊卵母细胞并进行玻璃化冷冻保存,未经处理的新鲜卵母细胞为对照组。结果表明:采用浓度为0.5μmol/L紫杉醇预处理绵羊卵母细胞冷冻保存效果最佳,其解冻后的存活率(82.38%)与其他3个试验组相比有显著差异性(P0.05);体外受精卵裂率(51.17%)和桑囊胚率(20.30%)也显著高于其他3个试验组(P0.05),但低于对照组(69.42%,34.77%)(P0.05)。由此可见,以0.5μmol/L浓度的紫杉醇预处理组绵羊体外成熟卵母细胞冷冻后能获得较好的效果。     

水牛卵母细胞的体外受精及其胚胎发育的研究

本研究比较了不同来源的水牛卵母细胞的体外受精及其胚胎发育。对10头摩拉母水牛连续6周进行活体采卵,共采集292枚卵母细胞,头均回收卵母细胞4.87枚,头均A级卵数为3.07枚,从屠宰场收集74头水牛卵巢共采集559枚卵母细胞,头均回收卵母细胞和A级卵母细胞分别为7.55枚和5.20枚,均显著高于活体采集的水牛卵母细胞(P<0.01)。将收集的AB级水牛卵母细胞在相同的条件下进行体外成熟、体外受精和体外培养至囊胚。结果表明,活体采卵组和屠宰水牛卵母细胞组受精分裂率差异不显著,分别为54.81%和57.73%。屠宰水牛卵母细胞组的囊胚率则高于活体采卵组(28.78%vs21.34%,P<0.05)。利用两组的胚胎进行常规法冷冻保存,冻胚解冻后的存活率差异不显著(P>0.05)。     

细胞松弛素B对绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

本试验通过玻璃化冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理来分析CB对绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻/解冻后发育潜力的影响。分别从细胞毒性检测、冷冻检测和CB不同浓度（6.0、7.5和9.0 μg/ml）处理3个方面进行试验。试验结果表明毒性检验中CB处理组和未处理组卵母细胞的成熟率都显著低于对照组(P<0.05)，但相互之间差异不显著；玻璃化冷冻后，卵母细胞成熟率显著低于未冷冻组(P<0.05)，玻璃化冷冻CB处理组和未处理组卵母细胞体外成熟培养后成熟率之间差异不显著(P>0.05)；不同CB浓度处理后9.0 μg/ml组卵母细胞的成熟率显著高于对照组（P<0.05）。     

玻璃化冷冻对猪MⅡ卵母细胞皮质颗粒分布及其激活后胚胎发育能力的影响

本实验旨在探讨玻璃化冷冻保存对猪MⅡ期卵母细胞皮质颗粒分布和孤雌激活后早期胚胎发育能力的影响。实验将卵母细胞随机分为对照组、毒性实验组和冷冻组。采用EFS40和EDFS40两种玻璃化冷冻液处理,卵母细胞经恢复后对其进行染色,观察皮质颗粒的分布;并对另一部分卵母细胞实施孤雌激活,观察早期胚胎的发育。结果表明:毒性实验组和冷冻组卵母细胞皮质颗粒部分释放、完全释放的比例无显著差异,但均显著高于对照组(P<0.05)。不同毒性处理组和不同冷冻组间对皮质颗粒的分布无显著差异。与毒性实验组相比,冷冻处理组显著降低皮质颗粒在皮质区分布的比例(P<0.05)。EFS40毒性实验组孤雌激活后的存活率、卵裂率、囊胚发育率均显著高于EDFS40毒性实验组(86.6%vs.75.0%)、(61.8%vs.40.7%)、(30.2%vs.23.5%)(P<0.05)。EFS40冷冻组存活率显著高于EDFS40冷冻组,但均显著低于对照组。结果显示,抗冻保护剂处理和玻璃化冷冻均导致猪卵母细胞皮质颗粒释放,与EDFS40相比采用EFS40较适合猪MⅡ期卵母细胞冷冻保存。     

不同超数排卵方法所获羔山羊卵母细胞体外成熟率及体外受精率的比较

本研究观察了不同超排处理方法对羔山羊卵母细胞体外成熟及体外受精的影响，并将体外受精胚胎进行了移植，以便探讨利用羔山羊卵母细胞生产体外受精胚胎的技术途径。对２～４月龄羔山羊用ＦＳＨ、ＦＳＨ＋ＬＨ（静脉注射）和ＦＳＨ＋ＬＨ（肌肉注射）三种方法进行超排处理，平均分别回收１６．０、２０．３和１５．０枚卵母细胞。将这些卵母细胞进行２０～２４ｈ的成熟培养后，其成熟率分别为４５．５％，４４．４％和７６．５％。成熟卵母细胞经体外受精，体外发育培养后其２～４细胞胚胎的发生率分别为５．６％ａ、６．７％和３１．７％ｂ（ｂ，ｖｓ，ａ，Ｐ＜０．０５）。将９枚２～４细胞期胚胎移植给６只受体母羊，结果有２只妊娠并产羔２只。     

犊牛超数排卵方法的研究

本试验采用不同超排处理方案对不同月龄犊牛(1~6月龄)进行超排处理,以得出犊牛超数排卵的最佳方案、最佳月龄和重复超排的最佳时间间隔。结果表明,超排方案4的超排效果最好,平均采卵数(80.0枚)、平均回收卵数(43.3枚)和平均可用卵数(37.8枚)均显著高于其他4个方案(P<0.05),表明超排方案4比较适合3月龄犊牛的超数排卵;2、3、4、5月龄犊牛应用超排方案4的超排效果较好,差异不显著,平均可用卵数分别为33.5、41.0、34.5、32.8枚,1、6月龄犊牛的超排效果显著差于其他4个月龄组(P<0.05),平均可用卵数分别为10.8、18.3枚,表明超排方案4处理犊牛的最佳月龄为2~5月龄;超排间隔2周组(6.3枚)平均可用卵数效果显著差于间隔3、4和5周组(16.7、23.7、23.0枚)(P<0.05),超排间隔3、4、5周组之间超排效果差异不显著,表明犊牛重复超排处理的最佳时间间隔为3~4周。     

母兔超数排卵影响因素的研究

采用国产促性腺激素对新西兰白兔进行超数排卵试验,研究激素、季节及兔龄对超排效果的影响。结果发现:①FSH组(30.05±8.97个/只)平均排卵数显著高于PMSG组(22.46±5.18个/只)(P＜0.05)。②母兔在春季、夏季、秋季、冬季的平均排卵数为32.34±5.58、15.96±4.11、24.18±4.95和22.61±3.75个/只,春季的处理效果显著优于其他3个季节(P＜0.05),而秋季和冬季处理组之间没有显著差异(P＞0.05),但都显著高于夏季(P＜0.05)。③经产母兔超排处理后的平均排卵数(30.56 ± 6.79个/只)显著高于青年母兔平均排卵数(21.60 ± 3.66个/只)(P＜0.05)。以上结果表明,SH超排效果优于PMSG,且在春季对母兔进行超排处理比较合适,经产母兔比青年母兔超排效果更好。     

乙二醇及二甲基亚砜对小鼠卵母细胞冷冻后纺锤体及孤雌激活后发育能力的影响

试验采用EFS30、DFS30和EDFS30冷冻液对小鼠MⅡ期卵母细胞进行玻璃化冷冻,并对冷冻-解冻后卵母细胞存活率、纺锤体形态正常率、孤雌激活胚胎的发育能力进行研究。结果表明:利用EDFS30冷冻-解冻卵母细胞后的存活率(98.3%)显著高于EFS30组(88.2%)和DFS30组(89.5%)(P0.05);DFS30组纺锤体形态正常率(44.9%)显著低于其他各组;而孤雌激活后EFS30、DFS30、EDFS30和对照组之间卵裂率(59.1%、56.3%、59.3%和60.0%)、囊胚率(52.0%、53.7%、61.2%和62.1%)和囊胚细胞数(49、48、50、50)均无显著性差异(P0.05)。综上所述,3种冷冻液冷冻卵母细胞孤雌激活后均可获得较好的体外发育能力,其中EDFS30较适宜小鼠MⅡ期卵母细胞冷冻保存。     

猪MII期卵母细胞的玻璃化冷冻的初步研究

试验采用3种冷冻载体(麦管、开放式拉长麦管和半麦管)对猪卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响进行研究,以探讨采用自制半麦管作为载体对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响.结果发现,采用半麦管法、OPS法玻璃化冷冻的猪卵母细胞的形态完整率、存活率、卵裂率分别为90.85%、60.07%、20.43%和84.15%、55.71%、14.71%,无显著差异(P＞0.05),但采用半麦管法的结果好于OPS法;与麦管法的形态完整率、存活率和卵裂率(分别为60.06%,39.64%和0)均有显著性差异(＜0.05).结论为采用半麦管法玻璃化冷冻猪卵母细胞可以稍微提高其冻后发育能力.     

体内、外卵母细胞对猪体细胞克隆胚胎发育潜力的影响

为探讨猪体内、外成熟卵母细胞对核移植重组胚胎发育能力的影响,试验通过激素促排获得体内成熟卵母细胞和收集废弃卵巢获取体外成熟的卵母细胞,分别构建核移植重组胚,比较其卵裂率、囊胚率及胚胎移植受孕情况。结果显示,PGC+PMSG+HCG组的平均排卵数（27.8枚/头）显著高于PGC+HCG （12.5枚/头）、PMSG+HCG （13.7枚/头）及自然发情组（11.5枚/头）（P<0.05）,体内收集到的卵母细胞,可用于构建核移植重组胚的可用卵率均达到90%以上,与其他处理组差异不显著（P>0.05）,说明通过激素处理可获得更多的可用卵母细胞,而且卵母细胞的质量没有显著差异;以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎,二者的胚胎融合率（80.31%和79.29%）和卵裂率（90.40%和86.51%）差异均不显著（P>0.05）,但来自体内成熟卵母细胞克隆的胚胎发育至囊胚期的比例显著升高（P<0.05）;将体内、外成熟卵母细胞构建的核移植重组胚分别移植代孕母猪,头平均移植30或60枚时,体内成熟卵母构建的克隆胚胎移植出生仔猪10头,而体外培养卵母细胞构建的克隆胚胎均未着床受孕,表明通过激素促排获得的卵母细胞质量更好,能显著提高克隆胚胎的囊胚率,减少胚胎移植数量,提高代孕母猪的怀孕率。     

甘氨酸对水貂GV期卵母细胞冷冻保存效率的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻及培养过程中添加甘氨酸（glycine，Gly）对水貂GV期卵母细胞冷冻解冻后存活率、核发育、线粒体和皮质颗粒分布的影响。试验分为3组：对照组（没有进行冷冻处理）、冷冻组和Gly添加处理组（1 mmol/L Gly）。对玻璃化冷冻解冻后的水貂GV期卵母细胞分别进行平衡恢复3 h和体外成熟培养，采用免疫荧光标记法检测各组GV期卵母细胞线粒体分布的差异及MⅡ期皮质颗粒分布的变化。结果显示，Gly添加处理组卵母细胞在解冻后3 h的存活率与冷冻组相比差异不显著（P>0.05），但显著低于对照组（P<0.05）；Gly添加处理组卵母细胞的减数分裂恢复率显著高于冷冻组（P<0.05），但与对照组相比差异不显著（P>0.05）。免疫荧光结果显示，Gly添加处理组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率显著高于冷冻组（P<0.05），但Gly添加处理组和冷冻组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率均显著低于对照组（P<0.05）。皮质颗粒分布结果显示，水貂GV期卵母细胞在冷冻后体外成熟培养至MⅡ期时，Gly添加处理组皮质颗粒的正常皮质区分布比例显著高于冷冻组（P<0.05），但Gly添加处理组与冷冻组的正常皮质区分布比例均显著低于对照组（P<0.05）。结果表明，添加Gly可以提高冻融后水貂卵母细胞的减数分裂恢复率，降低冷冻对其线粒体及皮质颗粒的损失。