山东部分地区农户家蚕软化病病毒性状分析

<正>从山东省养蚕户发生的软化病病蚕中收集、分离、纯化山软化病病毒,经病原性和抗原性两个方面的分析,初步证明为家蚕浓核病病毒,说明在我国长江以北地区也有浓核病的存在.七十年代初,日本学者从养蚕农家发生的软化病病蚕中,曾分离出与传染性软化病病毒(infectious flacherie virus——IFV)不同的另一种浓核病病毒(densonucleio virus—DNV).     

关于DNV佐久株的研究综述

前言1929年法国的 Paillot 提出家蚕的空头性软化病是由病毒引起的。从此就结束了蚕的空头性软化病由细菌引起的历史。1960年将由此病毒引起的软化病正式命名为:病毒性软化病或传染性软化病。而此病毒即命名为:传染性软化病病毒。通过蚕病学者们的大量研究,确认此病毒属于微核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、肠道病毒属(Entero-virus)的病毒。然而松井(1973年)、古田(1973年)、Himeno等(1974年)、清水(1974年)相继发现了能引起家蚕软化病症,而又不同于原先发现的传染性软化病病毒的新病毒。这些新发现的病毒当时就分别称为:松井株、古田株、姬野株、伊那株。其中姬野株被认为是传染性软化病病毒粒子的未成熟型,而松井、古田、伊那株则是完     

家蚕浓核病毒的研究

<正> 家蚕浓核病与传染性软化病由于其外部症状,发病规律及病毒形态均十分相似,因而长期以来两者混淆不清。七十年代中期日本把家蚕浓核病毒(DNV)作为传染性软化病病毒(FV)的一个毒株,七十年代后期通过对病毒的生化分析才确认这是两类完全不同的病毒,最近在日本除浓核病毒伊那株外,又分离出了山梨标及佐久株,这些病毒虽然都是以单链DNA为核酸的浓核病毒,但其抗原性、病原性及病毒结构蛋白分子量则各不相同。我国在1959年先于日本证实生产上所发生的家蚕空头性软化病是由病毒引起,1979年起我们开始对本病毒进行了较系统而深入的研究。     

家蚕传染性软化病病毒荧光定量PCR检测技术及浙江省流行病学调查

荧光定量PCR检测技术可实现对病原微生物的早期或快速检测,根据家蚕传染性软化病病毒(BmIFV)的RNA序列,设计了具有物种特异性的引物和探针,建立了荧光PCR检测BmIFV的方法。将设计的引物和探针同时对BmIFV、家蚕微孢子虫(Nb)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕浓核病病毒(BmDNV)和桑叶进行特异性验证,结果显示只有BmIFV得到阳性结果。该方法对含BmIFV目标片段质粒的检测灵敏度达10~(-3)ng/μL,对目标病毒的检测灵敏度为3.4ng/μL。同时,对浙江省嘉兴市秀洲区、湖州市南浔区、嘉兴市桐乡市、嘉兴市海宁市、杭州市淳安县5个蚕区家蚕感染BmIFV情况进行了流行病学调查,结果显示这5个蚕区BmIFV感染率约为3.6%,为浙江省家蚕传染性软化病防治提供参考。     

传染性软化病病毒感染家蚕中肠上皮细胞的免疫电镜观察

家蚕传染性软化病病毒(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV)专一地侵染家蚕中肠上皮组织,造成中肠上皮细胞的超微结构发生病变,在染毒家蚕的中肠杯形细胞内形成特异性小泡体和电子稠密体等特异性结构。电镜观察显示,在感染早期,微绒毛膜、线粒体附近及相邻两个细胞的细胞膜和内质网中较易发现胶体金颗粒(10 nm)的吸附;其后在微绒毛中间和细胞质中,以及内质网和特异性小泡体的界限膜附近出现或较多存在,但线粒体和特异性小泡体的内部未见金颗粒的吸附。因此可以认为:家蚕传染性软化病病毒主要在染毒细胞的各细胞器膜附近出现。     

H7N2禽流感病毒CK/HB/1/02株NA全基因序列分析

采用RT-PCR扩增了国内H7N2禽流感病毒(AIV)CK/HB/1/02分离株的完整神经氨酸酶(NA)基因节段,测定了其核苷酸序列,并与GenBank中AIV NA基因序列进行了同源性比较和氨基酸编码分析,绘制了NA基因的系统发育进化树。结果表明,AIVCK/HB/1/02分离株NA基因的完整序列长度为1467bp,包括5′-末端和3′-末端的非编码区,其最大阅读框(ORF)编码469个氨基酸,第61~65位氨基酸序列为-NITGI-,不同于国内H9N2AIV的特殊遗传标记。该病毒NA基因的核苷酸序列与GenBank中人类流感病毒A/Leningrad/134/57(H2N2)的NA基因同源性最高,为93.3%;其次为香港的鸭源、人源、猪源H3N2病毒(89%~93%);而与我国北京、广东、香港和韩国的H9N2AIV以及美国的H7N2AIV的同源性较低(85%~88%)。在N2基因系统发育进化树中,CK/HB/1/02分离株处于欧亚分支内,与H2N2人流感病毒的亲缘关系较近;与北美H7N2AIV处在不同分支,遗传距离较远。     

广西某鸡群呼吸道综合征的病原学分析

本研究对临床上患呼吸道感染的病鸡进行病原检测,分离到1株传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)和1株传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),此外还从病鸡肝脏等组织中分离到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。对IBDV分离株NN160401的VP1-b、v VP2基因以及IBV分离株GX160421的S1基因分别进行扩增、测序以及序列的相似性比较和遗传进化树分析。结果发现,分离株NN160401为基因重排毒株,其VP1-b与HLJ-0504株的序列相似,v VP2则具有IBDV超强毒株特征;分离株GX160421的S1基因序列与广西分离株亲缘关系较近,属于近年报道的New-typeⅡ,但与其他参考株及疫苗株H120的核苷酸相似性仅为58.8%~67.2%。综合分析表明,该病鸡群为早期感染IBDV造成了机体的免疫抑制,后来继发IBV的感染并伴发了细菌感染。     

猪传染性胃肠炎病毒TS株非编码区的克隆及其一二级结构的分析

参照GenBank中Purdue株全序列对5′和3′非编码区各设计一对特异性引物,经RT-PCR分别获得了2 957 bp和516 bp大小的片段,与预期结果大小相符。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TS株与Puedue株、TH-98和FS772/70株的5′UTR核苷酸序列同源性分别为99.4%,99.3%,99.0%,TGEV TS株的3′UTR与Miller、Purdue、Niigata、h-5株的核苷酸同源性均为100.0%,与Aomori和Ogawa的同源性为99.3%。对非编码区的二级结构进行分析发现其具有复杂的二级结构。     

禽呼肠孤病毒C-98、T-98分离株S2基因的克隆及序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株(ARV 176)S2基因设计引物,对禽呼肠孤病毒内蒙古地区分离株C-98和禽呼肠孤病毒天津地区分离株T-98进行总RNA的提取,以其为模板,应用RT-PCR方法扩增病毒S2基因的cDNA片段,将纯化的cDNA片段克隆到pEASY-T1载体后进行序列测定。结果表明,获得的ARV C-98和ARV T-98的S2基因全长为1324bp,包括15bp的5′非编码区和58bp的3′非编码区,阅读框位于5′端第16位核苷酸和第1266位核苷酸之间。ARV C-98和ARV T-98分离株S2基因的核苷酸同源性很高,达到了99.8%,将C-98、T-98株的S2基因核苷酸序列和参考毒株的S2基因序列进行同源性分析,结果表明,ARV C-98和ARV T-98分离株的S2基因与参考毒株ARV 176、ARV 918、ARV 919、ARV 1733、ARV GX2010、ARV S1133和DRV YJLS2基因的核苷酸同源性最高,在99.2%～99.8%之间;与参考毒株ARV 138和ARV AVS-BS2基因的核苷酸同源性在92.1%～94.1%之间;与参考毒株ARV601SI、ARV 916和ARV 1017-1S2基因的核苷酸同源性在87.3%～87.8%之间;与参考毒株DRV 091、DRV S12和DRV S14 S2基因的核苷酸同源性在77.3%～78.2%之间;与参考毒株MRV 3、MRV 3-jin-1和MRV 3-T3D S2基因的核苷酸同源性最低,在2.4%～5.5%之间。遗传进化树分析显示:ARV C-98和ARV T-98分离株与参考毒株共分为4个遗传进化分支。     

两株传染性法氏囊病病毒5′和3′非编码区结构分析

采用快速扩增cDNA末端 (RACE)方法测定了我国超强毒株Harbin 1和经典弱毒株CJ80 1的非编码区。在两株病毒基因组A节段中 ,Harbin 1的 5′非编码区包括 10 0个核苷酸 ,CJ80 1包括 96个核苷酸 ;两个毒株B节段的 5′非编码区均含有 111个核苷酸。Harbin 1毒株A节段的 3′非编码区含 95个核苷酸 ,CJ80 1含 94个核苷酸。Harbin 1毒株B片段的 3′非编码区含 79个核苷酸 ,CJ80 1含 82个核苷酸。结构分析表明 :超强毒株Harbin 1与细胞适应株CJ80 1的 5′和 3′端非编码区在一级和二级结构上均存在差异。Harbin 1与欧洲超强毒株的关系最近 ,CJ80 1与欧洲细胞适应株同源性最高。IBDV非编码区结构特征的研究为进一步研究IBDV非编码区的功能 ,阐明其与病毒复制调控和毒力的关系奠定了基础。     

5种家蚕病毒的密码子及密码对使用模式分析

通过分析5种家蚕病毒基因组密码子和密码对使用模式,初步探讨5种家蚕病毒的基因组进化和对宿主的适应策略。采用生物信息学方法对碱基含量(GCall、GC1、GC2、GC3、GC3s)、有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、密码对(codon-pair)等进行统计分析的结果表明:5种家蚕病毒的密码子偏好性均较低,病毒间的碱基组成及ENc值差异较小,碱基组成对密码子使用模式影响较小;不同病毒选择不同的偏好性密码子,不同病毒的密码对偏好性程度不同,其中,家蚕类葡萄斑点病毒(Bombyx mori macula-like virus,BmMLV)密码对偏好性最强,家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)密码对偏好性最弱。聚类分析表明BmCPV和家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)的密码子使用模式相似,BmNPV和家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infec-tious flacherie virus,BmIFV)的密码子使用模式相似;BmMLV、BmNPV和BmDNV的密码对使用模式相似,BmIFV和BmCPV的密码对使用模式相似。5种病毒的偏好性密码子和偏好性密码对不同,显示不同病毒的密码子和密码对的进化路径不同,对宿主的适应策略不同。     

63株IBV分离株M基因的遗传变异与系统进化分析

对1993－2010年从中国不同地区分离的63株传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)野毒株,采用RT-PCR方法克隆测定所分离野毒株的M基因核苷酸序列,并与GenBank中公布的部分国内外IBV毒株的M基因序列进行比较分析,研究中国IBV的分子流行病学特点和分子遗传变异规律。结果显示,所测毒株M基因具有6种不同长度的开放阅读框,这些长度的差异是由于5'端的核苷酸插入或缺失造成的;N端含有1~2个N-糖基化位点,其中1个糖基化位点"Asn-Cys-Thr"(NCT)是高度保守的。63个IBV分离株间氨基酸序列相似性为88.9%~100%,分离株与参考株间相似性为87.2%~100%。系统进化分析结果显示,本研究的63个IBV分离株可分为9个基因型,2005－2010年IBV中国流行株大部分与Mass型疫苗株处于不同的基因型,而且氨基酸序列相似性都小于94%。     

鸡传染性支气管炎病毒SX01株的分离鉴定及M基因序列分析

本试验通过鸡胚矮小试验、血凝试验和RT-PCR等方法,从华北地区某鸡场发生疑似肾型传染性支气管炎的发病鸡群分离了1株鸡传染性支气管炎病毒,命名为SX01株.结果显示该分离株能引起鸡胚典型的临床症状;经1%胰酶处理后的尿囊液可凝集鸡红细胞,而未处理的则无血凝活性;利用RT-PCR对分离株M基因序列测定分析结果显示,SX01株的M基因核苷酸序列与GX-GL分离株同源性高达99.4%,与QX基因型毒株SDZB0808核苷酸同源性高达99.1%,与H120株同源性仅为90.0%,与BJ/00/02株M基因核苷酸同源性较低,为90.6%.遗传进化分析结果显示,该分离株与中国地方型分离株(GX-GL、SDZB0808、CK/CH/LJL/110302、DY07、IBVSX7)亲缘关系较近,位于同一进化分支;与H120代表的Mass型疫苗株的亲缘关系较远,是一株肾型传染性支气管炎病毒毒株.     

牛病毒性腹泻病毒JY株分离鉴定

为了对疑似含有牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的种公牛精液进行检测并分离病毒,本研究采用细胞培养、免疫荧光及纳米PCR技术,对采自吉林省某牛病毒性腹泻(BVD)发病牛场中使用的种公牛精液进行检测与病毒分离。共采公牛精液8份,接种牛肾细胞系(MDBK)进行分离培养。分离得到阳性毒株为非致细胞病变(NCP)型,测得第4代病毒效价为10^6.25TCID₅₀/mL。纳米PCR检测5′-UTR和E2基因,测序后与GenBank上已发表的BVDV流行毒株核酸序列比对和进化分析。结果表明,分离毒株属于BVDV-1型,与BVDVJL株亲缘关系最近,5′-UTR核苷酸同源性为100%,E2基因核苷酸同源性为99.3%,命名为BVDVJY株。研究显示,本次采集的种公牛精液携带BVDV-1型毒株。该牛场BVD的发生疑似与种公牛精液带毒有关,对牛场BVD的防治起到警示作用。     

犬副流感病毒分子克隆的构建及全基因组序列分析

为了解犬副流感病毒(CPIV)的基因组结构与遗传进化特征,应用RT-PCR分段扩增HRB-V毒株的5个片段,f1、f2、f3以及5′-末端和3′-末端,克隆到pHW2000载体中并进行测序。经序列拼接获得全基因组序列,与GenBank登录的副流感病毒代表毒株进行对比分析。基因序列分析表明,HRB-V株基因组全长15 246nt,含5′-末端、3′-末端和7个ORF具有副流感病毒基因组结构的典型特征;将结构蛋白F、HN以及全基因序列与参考毒株进行比较分析并做遗传进化树,结果表明,HRB-V与CPI-和CPI+属同一分支,亲缘性相近。核苷酸以及氨基酸序列同源性分析结果表明,HRB-V与各病毒株的F基因的核苷酸同源性在96.5%~98.8%之间,氨基酸同源性为94.2%~98%;HN基因的核苷酸同源性在98.1%~99.5%之间,氨基酸同源性为97%~99.3%。以上试验证明副流感病毒人、猴、猪和犬SV5分离株基因差异较小,具有高度同源性。研究副流感病毒分子克隆的结构,为研究犬副流感病毒反向遗传操作技术平台奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒松原分离株的分离鉴定及B2L基因的克隆与序列分析

利用原代犊牛睾丸细胞从临床上表现口疮症状的羔羊痂皮材料中分离获得1株病毒,对该株病毒进行病毒形态学、理化学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为()RFV-sy.利用PCR方法克隆出其B2L基因,并将该基因序列和推导的氨基酸序列与6个不同来源的ORFV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析.结果表明,各毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.8%～99.5%和97.6%～99.5%;系统发育进化树结果表明,ORFV-sy毒株与印度分离绵羊株ORFV-Mukteswar 67/04、ORFV-Izatnagar 79/04的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的B2L基因差异不大.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离经典株与变异株的全基因组序列分析

通过分段设计引物,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LX、JX株基因组进行RT-PCR扩增,对各片段cDNA进行克隆和序列测定,拼接后获得全基因组序列。结果,PRRSV LX株全基因组序列长度为15 412 bp(不包括PolyA尾),PRRSV JX株全基因组序列长度为15 320 bp(不包括PolyA尾)。序列分析表明,JX株全基因组核苷酸序列与LX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、98.6%、91.0%、94.6%、90.9%、61.7%;LX株全基因组核苷酸序列与JX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、89.7%、99.7%、91.5%、99.7%、62.2%。对不同分离株的5′-UTR、Nsp2进行了序列比较,并根据5′-UTR、Nsp2、ORF5的基因序列和氨基酸序列,对国内外分离株进行了系统进化分析。根据5′-UTR核苷酸序列,可将PRRSV美洲型毒株分为4个亚群,LX株和JX株分别属于经典美洲型和"高热病"变异型。根据Nsp2氨基酸序列分析了不同分离株的分子进化关系,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为5个亚群,JX株独立于其他毒株,独自处于一个分支。依据ORF5序列也可将美洲型分离株划分为5个亚群。本研究为探讨PRRSV的分子进化奠定了基础。     

单克隆抗体诊断家蚕浓核病

<正> 养蚕中流行的家蚕浓核病,是造成蚕茧歉收的原因之一。本病是由家蚕浓核病病毒(BmDNV)感染蚕体后引起发病的,这种病毒是一种没有包涵体的昆虫病毒,与过去报导的传染性软化病病毒(IFV)不同,浓核病病毒为直径21nm的球状粒子,病毒核酸为单链DNA,侵入家蚕中肠,在园筒细胞核内形成病毒粒子,而传染性软化病病毒为单链RNA,直径约27nm的球状粒子,侵染家蚕中肠杯状细胞,在细胞质内形成病毒粒子。     

2株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征分析

为进一步掌握黔西南州猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行变异趋势,对2株高致病性PRRSV（HR-PRRSV）贵州分离株GZLPS、GZSB进行Nsp2与GP5基因克隆和测序,并分析毒株分子变异特征。结果显示,2株分离株Nsp2基因有90个核苷酸不连续缺失,不同位置的36个核苷酸发生突变;GP5基因存在不同位点置换。同源性比对与系统进化树分析显示,2株分离株Nsp2与GP5基因与HP-PRRSV JXA1株及贵州省2011年以前流行毒株的核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在95%以上,但在分子变异上存在差异。结果表明黔西南州PRRSV变异方式已呈多样性。     

1株麻雀源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到1株坦布苏病毒,命名为SDS株,并对分离毒株进行毒力测定。应用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序,将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在Gen Bank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因组序列进行遗传进化分析。结果表明,该株坦布苏病毒的基因组全长为10 990 nt,包含94 nt的5'端非编码区、618 nt的3'端非编码区和一个开放阅读框(3 425个氨基酸),编码11种病毒蛋白;与Gen Bank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.4%,其中与鸭源WFZ株(KC990545.1)的核苷酸序列同源性最高为99.5%,与鹅源坦布苏病毒(duck eggdrop syndrome virus strain goose,JQ920424.1)和鸡源坦布苏病毒(CJD50,JF926699)的核苷酸序列同源性较低为98.9%。用Net NGlyc 1.0 Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点,分别位于5个不同病毒蛋白中。