抗草甘膦棉花突变体R1098对草甘膦抗性研究

为研究抗草甘膦棉花突变体对草甘膦除草剂抗性,以抗草甘膦棉花突变体R1098为材料,以其遗传背景亲本柯字棉312为对照,在无菌培养过程中分别加入不同浓度的10%草甘膦水剂和95%的草甘膦粉剂,考察幼苗的生长发育和POD活性变化,研究结果表明柯字棉312对两种草甘膦除草剂均较为敏感,低浓度草甘膦处理情况下即枯萎死亡;抗草甘膦棉花突变体R1098对95%草甘膦粉剂抗性较强,随着草甘膦粉剂处理浓度的增加,各项指标未见显著差异,而对10%草甘膦水剂抗性较差,随着草甘膦水剂处理浓度的增加,各项生长发育指标显著的降低,POD活性显著的增加;当草甘膦处理浓度大于0.6 mmol/L时,在两种草甘膦除草剂之间抗草甘膦棉花突变体R1098幼苗全株鲜重、叶重、根重、下胚轴长度和POD活性等各项指标差异均达到显著水平;R1098对10%草甘膦水剂抗性较差,极有可能是因为10%草甘膦水剂本身含有严重阻碍R1098幼苗生长发育的其他有害物质。综上所述,抗草甘膦棉花突变体R1098对草甘膦粉剂具有良好的抗性,该非转基因种质在棉花育种和生产上均具有重要意义。     

通过草甘膦浸种鉴定抗草甘膦棉花

以转基因抗草甘膦棉花种质"G6-1"及其非转基因遗传背景亲本对照"中棉所49"为材料,研究了草甘膦浸种对棉花幼苗生长发育的影响。结果表明,抗草甘膦棉花种质"G6-1"和对照"中棉所49"在种子出苗率、棉花幼苗全株鲜重和可溶性蛋白增量等各项指标间差异均达到显著水平;当用大于0.5%浓度的草甘膦浸种时,"中棉所49"幼苗不能出土、鲜重已降到最低并枯萎死亡,而抗草甘膦棉花种质"G6-1"幼苗生长发育正常,这进一步证实了通过草甘膦浸种法鉴定抗草甘膦棉花是可行的;当浸种用草甘膦浓度达到3.0%,即使抗草甘膦棉花幼苗鲜重也出现显著的降低,所以推荐使用0.5%~1.0%浓度的草甘膦进行浸种鉴定。     

转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探

【目的】为培育高抗草甘膦棉花新品种提供种质材料。【方法】对草甘膦抗性基因G10eve进行生物信息学分析,利用农杆菌介导的方式将G10eve导入到珂字棉312中。利用PCR(Polymerase chain reaction)、qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)方法分析G10eve的表达情况。对受体及转基因植株进行草甘膦喷施实验,测定其莽草酸含量,分析其抗性水平。【结果】最终获得28个独立的转基因阳性系,转化率及幼苗分化率分别高达49.3%、40.6%。PCR及qRT-PCR检测证明外源G10eve基因已经整合到棉花基因组中,且在不同转基因株系间表达量差异显著。在子叶期,转基因植株可耐受8 mL·L~(-1)浓度的草甘膦,而非转基因对照在2 mL·L~(-1)浓度草甘膦处理下已出现药害。草甘膦处理前后,转基因植株叶片莽草酸含量未出现明显积累,进一步说明其具有草甘膦抗性。【结论】过量表达G10eve基因能够提高受体材料对草甘膦的抗性,获得了高抗草甘膦的棉花株系。     

外源激素对棉花前期生长发育的影响

 以鲁棉28为材料,在大田条件下设置吲哚乙酸（IAA）5 mg·L^-1、10 mg·L^-1,6-苄基腺嘌呤（6-BA）50 mg·L^-1、100 mg·L^-1,赤霉素（GA）20 mg·L^-1、50 mg·L^-1 6个不同浓度水溶液处理,以清水为对照,在苗期至蕾期叶面喷施3次,研究外源激素对棉花前期生长与发育的影响。结果表明,外源激素处理后,棉花主茎纵向生长速度缓于对照,茎粗大于对照。50 mg·L^-1 GA处理的棉株出叶速度、单株叶面积高于对照。6个处理的棉株主茎功能叶叶绿素SPAD值均高于对照。不同浓度IAA、GA处理均促进棉花现蕾,其中20 mg·L^-1 GA处理棉花单株现蕾数多于对照。本试验条件下,苗期叶面喷施IAA 和GA能协调棉花营养与生殖生长,促进蕾的发育,GA处理效果优于IAA处理,其中20 mg·L^-1GA效果最佳,6-BA处理未能促进棉花现蕾。     

转EPSPS基因抗草甘膦棉花的遗传分析

为分析转基因抗草甘膦棉花早代遗传情况,以花粉管通道法获得的26个转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)抗草甘膦棉花转化事件为材料,以其背景亲本中棉所49为对照,喷施草甘膦后对转基因棉T1、T2分离比例进行考察。T1田间抗性鉴定结果表明,经卡方检测20个转化事件T1分离符合3∶1的分离规律,即外源基因插入1个位点;6个转化事件不符合1对基因的分离规律,出现了偏分离。T2田间抗性鉴定结果表明,通过花粉通管法共获得152个纯合株系,分别来源于25个转化事件;对T2不纯合株系继续进行分离比例的考察,发现来源于15个转化事件的57个株系符合3∶1的分离规律;此外卡方检测结果表明,每个转化事件都有不符合3∶1分离规律的株系,且其中10个转化事件没有符合3∶1分离规律的株系。表明通过花粉管通道法获得的转基因植株中外源基因的整合和遗传均较复杂。     

棉花叶片蛋白质组双向电泳技术的优化

 以棉花叶片为材料,针对试材中含有大量色素、酚、醌等干扰物质的问题,从蛋白提取方法、裂解液成分、上样量等方面对棉花叶片蛋白质组双向电泳技术进行优化。结果表明：采用改良的TCA/丙酮法提取棉花叶片总蛋白,含有7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲、4% CHAPS、80 mmol·L^-1 DTT、1 mmol·L^-1 PMSF、0.3%载体两性电解质的裂解缓冲液,上样量为600 μg,采用pH 4～7、24 cm的IPG胶条进行双向电泳时,2-DE图谱的蛋白点分布均匀、清晰且重复性好。本体系为开展棉花蛋白质组学研究奠定了技术基础。     

利用种子发芽试验检测抗草甘膦棉花新品系

通过室内发芽试验检验了3个棉花品种(系)时草甘膦除草剂的抗性.首先将41％的草甘膦设置了3个浓度梯度,即配置成40倍液、60倍液、80倍液,分别处理种子和出苗12 d的幼苗.结果表明,所选育的2个抗性材料在发芽率、发芽势和幼苗耐受性方面,均比非抗材料鲁棉研21有明显的优越性,同时也证明室内发芽试验是检测抗除草剂棉花抗性的一种快速有效的方法.     

新疆海岛棉的丛生芽诱导和茎尖遗传转化的研究

 以新疆海岛棉新海17号、新海14号、85H为材料,对海岛棉器官发生再生体系和遗传转化进行研究。结果表明：茎尖系统再生能力强,茎尖组培成苗率可达90.5%。在MSB5培养基中,6-BA浓度为0.5 mg ·L^-1时,芽诱导率最高;但每个外植体的出芽数所需的最佳浓度是1.5 mg·L^-1;当浓度为2.0 mg ·L^-1时,开始有抑制出芽的现象;每个外植体最多能诱导4个芽。用农杆菌介导法转化棉花的茎尖,对侵染的损伤和Kan的耐受能力强,对Kan棉花的茎尖选择压达100 mg· L^-1;抗性绿苗率可达88.9%。     

抗草甘膦棉花研究进展

抗草甘膦棉花最早于1997在美国释放,它是通过将编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因导入珂字棉312而获得的抗性株.抗草甘膦棉花在美国的种植面积占棉花总种植面积从1997年的3.2%到增加到2005年的60%左右.在这近十年内,抗草甘膦棉花虽然得到了广泛的种植,但也存在着不少问题,其中最为突出的是草甘膦的施用方法和时期的不正确操作对抗草甘膦棉花的根系生长、育性和产量都产生了负面影响.这主要是因为:1、外界因素,包括草甘膦施用方法在内的其他栽培措施和不利的环境条件,如高温,对抗草甘膦棉花的产量及生长的影响;2、内部因素,抗草甘膦棉花不同器官对草甘膦的吸收量及抗草甘膦基因的表达量差异有关.因此,本文从抗草甘膦棉花对草甘膦的吸收分配、草甘膦的施用量和时期对抗草甘膦棉花根系生长、花药开裂及产量等方面综述了这些年来抗草甘膦棉花在应用过程中的问题,并且对今后抗草甘膦棉花育种方面作了展望.     

冠菌素对棉花幼苗盐害的缓解效应

 以转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)中棉所45为材料,通过水培试验研究了冠菌素对盐胁迫下棉花萌发出苗和幼苗生长的影响。结果表明,盐胁迫严重抑制棉花种子萌发和幼苗生长,且对地上部的抑制程度大于对根系的抑制。盐胁迫对棉花萌发出苗和幼苗生长的抑制程度能被0.01 μmol·L^-1 的冠菌素缓解。苗期盐胁迫21 d内,冠菌素处理的棉花根、茎和叶的生物积累量较未施加冠菌素的盐处理增加1倍;活体组织化学原位检测结果显示,低浓度冠菌素处理降低盐胁迫诱导的主根H₂O₂含量。上述研究结果说明低浓度的冠菌素能提高棉花萌发出苗和苗期的耐盐性。     

草甘膦对转EPSPS-G6基因棉花种质系配子育性的影响

以转EPSPS-G6基因的抗草甘膦棉花种质系为材料,研究转基因抗草甘膦棉花植株现蕾后喷施不同浓度草甘膦后的花器形态结构和配子育性的影响.结果表明,苗期的草甘膦处理对转EPSPS-G6基因的棉花种质系植株生长发育无明显的影响,但现蕾后可导致转基因抗草甘膦棉花种质系花冠变小,花丝变短,柱头变长,花药皱缩、不能开裂,呈雄性败育的特征;高浓度(＞30 mmol· L-1)草甘膦处理尤其明显.花粉粒育性鉴定结果表明,草甘膦处理15～20 d后转基因植株的花朵雄配子即完全败育,其中,低浓度(＜20 mmol·L-1)下完全败育的时间为20 d,高浓度(＞30mmol·L-1)下完全败育的时间为15d.低浓度草甘膦处理的花粉粒的完全败育持续时间约20 d,高浓度草甘膦处理完全败育的持续时间更长.不同间隔时间喷施草甘膦的试验结果表明,间隔20 d喷一次草甘膦,即可在首次喷药20 d后保持完全不育.考虑到气候等因素,转基因抗草甘膦棉花可在现蕾初期喷施20 mmol· L-1的草甘膦,每隔15d(遇特殊气候可延长5d)喷1次,共喷4次,即可进行不去雄杂交棉制种.     

抗草甘膦基因aroA转化陆地棉胚性愈伤组织的研究

为了建立以草甘膦为选择标记的农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织转化体系,本研究将草甘膦抗性基因(aroA)转化陆地棉WC和YZ-1的胚性愈伤组织,分别以5 mg·L-1和10 mg·L-1的草甘膦浓度作为选择压,经过2~3轮筛选,获得了抗性胚性愈伤组织,诱导出胚状体并发育成苗。对T0再生植株进行PCR及草甘膦抗性检测,以WC和YZ-1为受体的转抗草甘膦基因(aroA)分别获得了33株和10株阳性植株,转化效率分别为82.5%和62.5%。该体系为棉花遗传转化提供了实验方法,获得的抗草甘膦棉花为棉花育种提供种质资源;同时抗除草剂基因还可以作为筛选标记与其它基因串联在一起转化棉花,进行基因功能验证。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

1 株抗草甘膦棉花突变体草甘膦抗性的初步鉴 定简

 目的在于探明1株新的草甘膦抗性棉花突变体是否能用于发掘新的草甘膦抗性基因以及在农业生产中作为抗草甘膦种质的选育和利用的潜在价值。本文采用PCR的方法,在基因组和转录水平上排除了CP4-EPSPS基因对该突变棉株的污染;通过测定莽草酸含量,鉴定了该突变体草甘膦抗性的典型生理特征;通过盆栽试验研究了该突变体苗期对草甘膦抗性的表型。结果显示：不论草甘膦处理与否,突变棉株莽草酸的含量都没有显著的积累,在生理水平上显示出草甘膦抗性植株的显著特点;2叶期时草甘膦处理结果显示,突变棉株的草甘膦抗性表型同孟山都的品种对草甘膦的抗性表型基本一致。在基因组和转录水平的PCR检测结果都排除了突变棉株草甘膦抗性的获得是CP4-EPSPS基因污染造成的。结合对其他已报道的草甘膦抗性基因的类似排除,说明该抗性突变存在着自身特有的分子机理。     

Generation and Glyphosate Resistance Analysis of G10eve Transgenic Cotton

[Objective] Novel germplasm of cotton was generated for development of cultivars with high resistance to glyphosate. [Method] The glyphosate resistance gene G10eve was preliminarily analyzed using bioinformatics methods and introduced into 'Coker 312' via Agrobacterium-mediated transformation. The expression of G10eve was estimated by PCR (Polymerase chain reaction) and qRT-PCR (Quantitative real-time PCR). The content of shikimic acid and tolerance to glyphosate were determined in response to application of glyphosate to 'Coker 312' and transgenic plants. [Result] A total of 28 independent positive transgenic lines were obtained. The transformation efficiency and the rate of seedling differentiation were up to 49.3% and 40.6%, respectively. PCR and qRT-PCR analysis showed that G10eve was integrated into the cotton genome, and the G10eve expression level differed significantly among the transgenic lines. At the cotyledon stage, the transgenic cotton showed resistance to 8 mL·L^－1 glyphosate, whereas 'Coker 312' showed phytotoxicity to the 2 mL·L^－1 glyphosate treatment. No significant accumulation of shikimic acid was detected in transgenic plants before or after glyphosate treatment, which indicated the typical physical characteristic of glyphosate resistance. [Conclusion] Overexpression of G10eve in cotton improved resistance to glyphosate. Thus, novel germplasm of cotton resistant to glyphosate was generated.     

EPSPS外源基因对陆地棉农艺性状和纤维品质的影响

以G6-1至G6-19等19个转基因抗草甘膦除草剂棉花种质为材料,以其非转基因背景亲本中棉所49为对照,研究EPSPS外源基因导入对陆地棉农艺性状和纤维品质的影响,结果表明外源基因的导入对棉花纤维上半部平均长度、马克隆值、断裂伸长率和断裂比强度等品质性状有显著影响;对于棉花衣分和铃重等农艺性状亦有显著的影响,衣分变异范围为30.5%~42.7%,T1和T2相关性分析表明衣分的变异为可遗传性变异,铃重最高为6.5 g,最低为4.6 g,两者相差40%。因此,转基因棉花育种研究不仅要注重目标性状的转育,还要注重非目标性状的筛选。     

转CP4-EPSPs基因大豆杂交后代对草甘膦的抗性水平与遗传背景的相关性

第一代抗草甘膦转CP4-EPSPs基因大豆GTS40-3-2是国际上应用时间最长、种植面积最大的转基因作物。本文以6份GTS40-3-2衍生的抗草甘膦转基因大豆新品系为亲本,配制4个杂交组合,利用抗性分级法和相对株高法鉴定杂交亲本及其F_(2:3)子代对草甘膦的耐受性差异,分析其抗性水平与遗传背景的相关性。结果表明,以1230 g a.i.hm~(–2)草甘膦喷施处理时,转基因亲本及其F_(2:3)子代的苗期生长受草甘膦抑制不显著,而当喷施浓度提高至3690 g a.i.hm~(–2)和4920 g a.i.hm~(–2)时则抑制作用显著。供试的6个杂交亲本中以ZLHJ06-1568、ZLHJ10-713和ZLHJ06-698对草甘膦的耐受性相对较强,而4个F_(2:3)组合中以ZLHJ10-713×ZLHJ06-698后代在草甘膦喷施后株高受抑制最小,对草甘膦耐受性最强。不同组合后代对草甘膦的耐受性普遍优于其双亲,呈现出杂种优势。各组合后代与亲本之间对草甘膦的耐受性均呈正相关,但由于亲本间互作效应的不同,导致后代抗性水平产生差异。本研究表明草甘膦抗性基因CP4-EPSPs在大豆中的表达水平与其遗传背景相关联,为利用转基因大豆新种质培育转基因大豆新品种过程中目标基因的定向选择提供了参考依据。     

转新型抗草甘膦基因棉花的转化效率及相关分子特征分析

培育抗草甘膦除草剂棉花品种对棉花生产具有重要意义。利用农杆菌介导法获得了大量抗除草剂草甘膦棉花的再生植株,对其进行阳性检测。通过确定PCR检测目标条带大小、蛋白杂交条带大小分子特征,对65个独立转化事件在DNA水平、蛋白水平进行分析和筛选。结果表明,经PCR检测再生植株DNA得到的阳性率平均值为81.5%,经过蛋白检测后阳性率确定为55.4%,该类阳性植株即为外源基因正常表达的转基因植株。在此基础上,结合田间抗性检测,对其中9个株系进行了不同世代的选择,经过综合鉴定筛选,发现2个抗性优良的转基因株系具有极高的利用价值,其余还需进一步筛选鉴定。     

Effects of Glyphosate on Soil Salinization and Alkalization in Cotton Fields

We analyzed the effects of glyphosate to the index of salinization and alkalization by simulation in soils collected from cotton fields in Anyang, Henan and Anqing, Anhui, China, in 2014. The results showed that application of glyphosate changed electrical conductivity (EC), total alkalinity (TAL), exchangeable sodium percentage (ESP), sodium adsorption ratio (SAR) and pH of soil in both regions，compared with the blank control. With increased frequency of glyphosate application and increased concentration applied, all indices increased in the Anqing cotton fields soil which were treated with concentrations of 2.5-20 g·L^－1 . However, EC, TAL and ESP increased dynamically in Anyang soil to which high concentrations of 20 g·L^－1 were applied only four consecutive times. After different glyphosate treatments, the soil pH value showed an upward trend but smaller changes. Therefore, after repeated use of glyphosate to soils of two different region soils, although the changes of all indices were within the range of non-saline and non-sodic soils, the soils affected by salt in the glyphosate aqueous solution tended towards saline-sodic soils.