苏博美利奴羊毛囊发育相关lncRNA与mRNA共表达网络的构建

【目的】 随着高通量测序技术的发展和完善,海量的转录组测序数据随之涌现,基因网络的方法也越来越多被用于研究中;细毛羊毛囊发育受多个基因及lncRNA共同调控,单独研究某一分子并不足以发现其调控机制,本研究旨在构建毛囊发育相关lncRNA和mRNA的共表达网络,挖掘细毛羊毛囊发育的潜在候选基因。【方法】 以苏博美利奴羊胎龄65 d（D65）、85 d（D85）、105 d（D105）、135 d（D135）的胎儿以及出生后7 d（A7）、30 d（A30）的羔羊肩胛部皮肤组织,每个时期有3个生物学重复,共18个样本,进行转录组测序以获得6个不同发育时期的lncRNA与mRNA表达谱数据,筛选出相邻时期的差异表达lncRNA与mRNA,运用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）方法构建共表达模块,使用DAVID在线工具进行GO（gene ontology）和 KEGG pathway富集分析以找到与毛囊发育相关的模块,最后从目标模块筛选高连通度的lncRNA与mRNA使用Cytoscape软件进行网络可视化。【结果】 从表达谱数据中筛选得到9 070个差异表达的lncRNA与mRNA,运用WGCNA方法得到11个模块,使用DAVID富集分析发现honeydew1、paleturquoise、skyblue2模块中的基因富集在皮肤发育、毛囊发育、毛囊形态发生、Wnt信号通路负调控、细胞粘附等生物过程,以及Wnt信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、紧密连接、MAPK信号通路、ECM-受体相互作用等毛囊发育相关的信号通路,并筛选这3个模块中连通度高的lncRNA和mRNA构建了子网络,得到包括TGFB2、CTSB、SFN、SPINT1、FAM83G、GSDMA、MPZL3、VIM、CRABP1在内的毛囊发育相关基因,预测出ENSOART00000029117、TCONS_00489976、TCONS_00376759等24个lncRNA的可能靶基因。【结论】 首次运用WGCNA方法构建了苏博美利奴羊毛囊发育相关lncRNA与mRNA的共表达网络,鉴别出3个毛囊发育相关的共表达模块,发现多个与毛囊发育相关的潜在候选基因,并预测出24个lncRNA可能的靶基因。     

基于miRNA测序数据解析苏博美利奴羊毛囊发育分子机制

【背景】羊毛由毛囊（hair follicle,HF）产生并控制,HF结构功能和形态发生是一个复杂的生物过程。细毛羊胚胎期HF发育过程决定了羊毛的产量和品质。苏博美利奴羊是我国自主培育的羊毛细度达17—19μm的精纺用超细毛羊新品种。超细毛羊HF形态发生过程中miRNA及其调控机制有待更为深入的研究。【目的】解析超细毛羊早期HF发育中miRNA的分子调控机制对于更好地理解HF形态发生过程以及对细毛羊的育种工作具有重要的指导意义,为解析超细毛羊HF发育分子调控机制和选育优质超细毛羊提供可参考的分子标记。【方法】对相同饲养条件下的苏博美利奴羊进行同期发情和人工授精,授精日被指定为胚胎第0天（E0）。在胚胎期第65天（E65）、85天（E85）、105天（E105）和135天（E135）将妊娠母羊安乐死后进行剖宫产收集胚胎的皮肤组织;在羔羊出生后第7天（D7）和30天（D30）采集左侧肩胛部皮肤组织,每个时期采3个样本。运用miRNA-Seq鉴定毛囊发育不同时期的保守miRNA和Novel miRNA,并构建苏博美利奴羊HF发育不同时期的皮肤组织miRNA文库。对差异表达miRNA(DE-miRNA)进行靶基因预测及生物信息学分析,筛选参与超细毛羊HF发育的关键miRNA和候选基因,并构建miRNA-靶基因调控网络。运用RT-qPCR和双荧光素酶报告基因检测方法验证miR-433-3p与NOTCH1的靶向关系。【结果】构建了苏博美利奴羊HF发育不同时期18个皮肤组织miRNA文库,并筛选出87个DE-miRNA和446个Novel DE-miRNA。对DE-miRNA聚类分析可知毛囊诱导分化阶段（E65、E85、E105）有21个DE-miRNA,其中有5个（oar-miR-23b、oar-miR-133等）是关键候选miRNA;毛囊成熟阶段（E135、D7、D30）有28个DE-miRNA。SOM分析结果表明DE-miRNA可聚为10个Cluster,每个Cluster中miRNA有相似功能。对DE-miRNA和Novel DE-miRNA进行混合预测靶基因并进行功能富集发现靶基因主要富集通路有AMPK、Notch、hedgehog。将DE-mRNA与靶基因结合生物信息学分析构建了与HF发育相关的miRNA-靶基因调控网络。在293T细胞中将NOTCH1野生型和突变型载体与miR-433-3p mimics和mimics-NC共转染,结果表明NOTCH1为miR-433-3p的靶基因。【结论】构建了苏博美利奴羊毛囊发育不同时期miRNA表达谱,分析了miRNA及其靶基因的表达调控关系,并构建了miRNA-靶基因调控网络,进一步了解了miRNA在毛囊发育不同时期的作用及分子机制;为解析超细毛羊毛囊发育分子调控机制和选育优质超细毛羊提供可参考的分子标记。     

中国超细毛羊（甘肃型）胎儿皮肤毛囊发育及其形态结构

【目的】探究中国超细毛羊（甘肃型）毛囊的组织结构与毛囊形态发生过程,为超细毛羊毛囊发育的分子调控机制研究奠定组织学基础。【方法】采用冰冻组织切片技术制作横切、纵切切片,在显微镜下观测照相。【结果】中国超细毛羊（甘肃型）毛囊结构包括连接组织鞘、外根鞘、内根鞘、毛干和毛球部。在胎龄87 d时初级毛囊发生形成毛芽,在初级毛囊基底部可见次级毛囊的囊泡结构。胎龄102 d时次级毛囊开始再分化。到胎龄138 d时,初级毛囊基本发育成熟。胎龄87—147 d,初级毛囊密度随胎龄增长逐渐降低,次级毛囊密度随胎龄增长逐渐升高,在胎龄102—117 d时次级毛囊增长迅速,在胎龄117 d时达到最大值（232.8±12.44）个/mm2,胎龄126 d时次级毛囊/初级毛囊比值达到最大值9.96。【结论】在胎龄84 d时初级毛囊开始发生,胎龄87 d时次级毛囊开始发生,胎龄102 d时在原始次级毛囊颈部隆突部开始再分化出再分化次级毛囊,胎龄108 d时原始次级毛囊大量再分化,胎龄 138 d时大部分初级毛囊和部分次级毛囊发育成熟;次级毛囊再分化是影响毛囊密度的最主要因素,它能有效地增加毛囊密度,提高羊毛细度。     

苏博美利奴羊胎儿皮肤毛囊结构及形态发育

【目的】研究苏博美利奴羊毛囊的组织结构与形态发育过程,为解析细毛羊毛囊发育的分子调控机制奠定组织学基础。【方法】采用石蜡切片技术分析胎龄为第65、85、105和135天的苏博美利奴羊胎儿头部、颈侧、颈上缘、鬐甲、背部、体侧、肩甲、腹部、荐部及股部等10个不同部位皮肤的组织学特性。【结果】苏博美利奴羊毛囊结构同其它动物一样,由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干等几部分组成。在胎龄65d时初级毛囊(primary follicles,PF)已经发生形成毛芽,毛芽延长,继续向真皮层深入,形成柱状结构,通过由大量真皮细胞在末端聚集,形成帽子结构,各部位表皮均形成完整的结构。胎龄85d时毛囊上部形成一个膨大部,在毛乳头上方形成锥形结构,毛球基本形成,毛乳头长度明显大于宽度;在初级毛囊基底部可见次级毛囊(secondary follicles,SF)的囊泡结构,并形成皮脂腺原始细胞。在胎龄105d时次级毛囊大量形成,伴随着初级毛囊毛芽伸长,次级毛囊毛芽向真皮层深入,毛乳头直径逐渐增大,皮脂腺开始形成;原始次级毛囊颈部隆突部开始再分化出再分化次级毛囊(secondary-derived follicles,SD),并可见汗腺,毛管发育完整;已形成完整的毛囊群结构,主要为三元毛囊群,每个毛囊群由1—3个初级毛囊和围绕其周围的几个次级毛囊组成。胎龄135d时大量形成再分化次级毛囊,形成成熟的汗腺,大部分初级毛囊和部分次级毛囊发育成熟,毛囊形成角质化毛干并穿出体表。【结论】苏博美利奴羊胚胎皮肤初级毛囊约50—55d开始形成;胎龄65—75d是初级毛囊形成的重要时期;胎龄80—85d是次级毛囊形成期,此时期,初级毛囊大量形成;胎龄105—135d是次级毛囊大量再分化,再分化次级毛囊形成及发育的关键时期。     

Hoxc13基因在苏博美利奴羊胎羔生长发育期不同组织中的表达分析

【目的】分析苏博美利奴羊不同组织中Hoxc13基因mRNA的表达量差异,为分子标记辅助育种以及,研究细毛羊主要经济性状,奠定理论基础。【方法】使用RT-PCR技术检测Hoxc13基因在苏博美利奴羊65和135 d皮肤、肌肉和不同内脏组织(心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏)中mRNA的表达量,并采用相对定量法对其表达量进行统计分析。【结果】在苏博美利奴羊皮肤、肌肉和不同内脏组织中均有Hoxc13基因的表达,并且在皮肤中的表达量显著高于其它组织(P<0.05),毛囊的形成和毛发生长与Hoxc13基因密切相关。【结论】建立了胎龄分别在65和135 d的苏博美利奴羊,其不同组织中适于定量检测的Hoxc13基因表达量的RT-PCR方法,从分子水平探讨了苏博美利奴羊的组织器官与Hoxc13基因表达之间的内在联系。     

中国美利奴羊(新疆军垦型)胎儿期皮肤毛囊结构及形态学观察

[目的]研究绵羊胎儿期的毛囊组织结构和发育变化,为调控毛囊生长发育、提高羊毛产量和品质提供基础.[方法]采集胎龄45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145d的33只中国美利奴羊(新疆军垦型)胎羊体侧部皮肤组织,每个发育时期重复3只,制作皮肤毛囊石蜡组织切片,经HE染色,显微镜下观察不同发...     

德国美利奴羊胎儿期骨骼肌组织学结构发育特征研究

【目的】探究胎儿期绵羊肌纤维的形成与发育规律,揭示德国美利奴羊胎儿期骨骼肌的组织学生长发育特征。【方法】选择妊娠期第75天(D75)、第105天(D105)和第135天(D135)的胎羊,测定其体长、体高和体质量;采集背最长肌,进行组织切片和HE染色,统计不同发育阶段胎儿单位肌纤维数量、直径和密度;应用免疫组化方法研究不同发育阶段背最长肌中快/慢肌纤维的类型和密度。【结果】随着怀孕母羊妊娠时间的增加,从75~135d胎儿体质量增长近17倍,体长、体高增加近1.5倍;单位肌纤维数量总体呈先增加后减少的变化趋势,在105d时单位面积肌纤维数量最高;肌纤维直径于妊娠75~105d增长幅度较为平缓,105~135d增长速率明显变大;早中期发育主要以慢肌(Ⅰ型肌纤维)为主,后期发育主要以快肌(Ⅱ型肌纤维)为主。【结论】德国美利奴羊胎儿肌纤维数量在妊娠105d时达到峰值,且此时肌纤维数量基本恒定,是肌纤维从肌增生转为肌肥大发育的关键时期,早中期发育主要以慢肌(Ⅰ型肌纤维)为主,后期发育主要以快肌(Ⅱ型肌纤维)为主。     

P-cadherin在‘高山美利奴羊’胚胎皮肤毛囊基板形成过程中的表达规律

【目的】研究P-cadherin在‘高山美利奴羊’皮肤毛囊(hair follicle,HF)基板形成过程中的分布及表达情况,初步探讨P-cadherin是否可以作为‘高山美利奴’羊毛囊基板的标记物.【方法】以90-114d胎龄的‘高山美利奴羊’腹部皮肤作为材料,通过冰冻切片、HE染色、荧光定量PCR、免疫组化技术研究P-cadherin在毛囊基板形成过程中的表达规律.【结果】免疫组化结果显示,P-cadherin在胚胎毛囊形成时期的表皮、表皮基底层、真皮、隆突基底层、基板以及毛芽中都呈现阳性表达.荧光定量结果显示,在胎龄90、96、102、108、114d的相对表达量分别为(0.016 7±0.008 4)(0.113 4±0.052 9)(0.937 8±0.245 3)(0.068 4±0.026 8)(0.062 3±0.045 6).90d与96d相比差异显著(P=0.049 30.05),96d与102d相比差异不显著(P=0.088 90.05),102d与108d相比差异显著(P=0.023 50.05),108d与114d相比差异不显著(P=0.512 40.05).96d以后的相对表达量高于90d的相对表达量.90d到102d相对表达量逐渐升高,102d以后相对表达量逐渐降低,108d以后相对表达量趋于平稳,但是略高于114d的相对表达量,有降低的趋势.【结论】初步可以断定P-cadherin可以作为‘高山美利奴羊’毛囊基板的标记物.     

济宁青山羊皮肤毛囊的组织学特性研究

以组织学技术与显微观测方法,对比研究了济宁青山羊小猾皮、大猾皮和成年羊皮肤毛囊的组织学特性.研究结果表明:济宁青山羊的毛囊是成群分布的,真皮毛囊层与网状层之间的界限不明显,毛囊的密度较小,组织间隙较大;毛囊与表皮呈45度倾斜.小猾皮的花纹美丽,图案清晰,其次级毛囊尚未发育完好,毛囊密度和毛囊直径都较小,使小猾皮平滑细腻,每个毛囊群仅由2-3个初级毛囊和1-2个次级毛囊组成;大猾皮和成年羊的毛囊群由1-5个初级毛囊和若干个次级毛囊组成,其中3毛囊群最多,占81.32%.大猾皮的毛囊群直径均极显著地大于小猾皮(P<0.01),发达的毛囊群使大猾皮表面粗糙.1岁龄成年羊一个毛囊群中次级毛囊与初级毛囊的比例(S/P)为5.68.皮肤毛囊的这些组织学结构特性决定了青山羊猾子皮和成年羊的毛皮品质.     

湖羊羔皮毛囊候选miRNA在不同花纹间的表达与毛囊发育特性关联的研究

【目的】通过前期高通量测序技术结合生物信息学分析研究湖羊大花、中花和小花羔皮毛囊间miRNA的差异表达,筛选出了14个候选miRNA,现进一步研究14个候选miRNA在不同花纹组间的表达量与毛囊各指标的相关性,以了解候选miRNA与毛囊发育特性间的关联,筛选用于后期功能验证的miRNA。【方法】利用高通量测序技术筛选湖羊大花、中花、小花不同花纹羔皮毛囊中的差异表达miRNA。利用与高通量测序同一批样品所提取的RNA进行RT-RCR验证,随机选取高通量测序结果中的5个差异表达miRNA,验证高通量测序结果的可靠性。通过荧光定量PCR技术检测14个候选miRNA在不同组别间的表达量,制作不同花纹羔皮组织的石蜡切片以评估不同毛囊的结构,并结合组织学观察与显微观测技术,采用SPSS 17.0分析14个候选miRNA的表达水平与毛囊组织学性质的相关性。【结果】湖羊毛囊成群分布,以3毛囊群的居多,直径较大的为中心初级毛囊,直径较小的为侧部次级毛囊。在显微镜相同视野中,湖羊大花、中花和小花3种不同类型花纹羔皮的初级毛囊数差异不显著（P＞0.05）,小花组的次级毛囊数多于大花组和中花组的次级毛囊数且差异极显著（P＜0.01）,中花组与小花组二者次级毛囊数相仿,差异不显著（P＞0.05）,在相同的单位面积中,小花的毛囊总数要高于大花组和中花组;大花组的初级毛囊直径比中花组和小花组的初级毛囊直径要大的多,与中花组和小花组的初级毛囊直径差异极显著（P＜0.01）,大花组的次级毛囊直径也比中花组、小花组的次级毛囊直径大,同时也与二者均呈极显著差异（P＜0.01）,中花组和小花组二者的初级毛囊直径以及次级毛囊直径均差异不显著（P＞0.05）;在已知的miRNA中,miRNA-143在大花组中的表达量与小花组差异极显著（P＜0.01）,miRNA-10a在小花组的表达量与大花和中花组差异显著（P＜0.05）,let-7i在大花组的表达量与中花组差异显著（P＜0.05）;在测序新预测的差异miRNA中,NW_004080184.1_6326在中花组的表达量与大花组差异显著（P＜0.05）、与小花组差异极显著（P＜0.01）,NW_004080165.1_8572在中花组的表达量与大花组和小花组差异极显著（P＜0.01）,NW_004080181.1_3961在中花组的表达量与小花组差异极显著（P＜0.01）,NW_004080190.1_13733在中花组的表达量与大花组差异极显著（P＜0.01）,其余miRNA在大、中、小花中的表达差异不显著。14个miRNA的相对表达量均与毛囊部分指标存在相关性,表明I4个miRNA均有可能参与毛囊的生长发育。【结论】 miRNA-143、miRNA-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961以及NW_004080190.1_13733 等7个miRNA可作为对湖羊羔皮毛囊发育具有重要影响的候选miRNA,在后续试验中将进一步验证。     

IGF-Ⅰ和EGF对绵羊毛囊体外培养的影响

在常规培养液中分别添加不同剂量的细胞生长因子IGFⅠ(100 ng.mL-1、10 ng.mL-1、1 ng.mL-1、0.1ng.mL-1)和EGF(100 ng.mL-1、20 ng.mL-1、2 ng.mL-1、0.2 ng.mL-1),观察毛囊体外培养过程中生长速度及毛囊形态结构的变化。结果表明,10 ng.mL-1IGFⅠ和20 ng.mL-1EGF对毛囊均具有明显的促生长作用,10 ng.mL-1IGFⅠ有刺激毛囊生长正向调节作用,20 ng.mL-1EGF可促进毛囊外根鞘细胞分化,并诱导毛囊由生长期提前进入退行期。10 ng.mL-1IGFⅠ和20 ng.mL-1EGF混合对毛囊生长有明显的促进作用。     

中国地方绵羊品种的地域分布及肉用相关性状的多元分析

【目的】中国畜禽遗传资源种类丰富,畜禽品种数量约占全球已知种类的1/6,是世界畜禽遗传资源最为丰富的国家之一。《中国畜禽遗传资源志》是在农业部的领导和组织下,经过8年的调查和编写而成,较好的总结了中国畜禽地方品种、培育品种和引入品种地域分布和性能特点。文章对《中国畜禽遗传资源志-羊志》中地方绵羊品种的重要生产性能相关性状作进一步分析,期望从中筛选出适合于肉用品种培育的素材。【方法】整理汇总《羊志》中地方绵羊品种的主要产地,以及体尺、胴体及繁殖方面共13个肉用相关性状信息。依据《羊志》将地方品种分为蒙古系、哈萨克系和藏系并对3大谱系进行多重比较,利用R语言中主成分分析和系统聚类分析方法对信息较全的地方绵羊品种进行聚类分析。【结果】从地理分布图可以看出中国绵羊地方品种分布广泛,以新疆、云南、内蒙古和山东4个省（自治区）品种数量最多,分别为13、7、5和5个。从地形分布来看中国地方绵羊品种主要集中在北部、西北部以及西南部高原地区。从绵羊谱系分布来看,哈萨克系品种主要集中在新疆地区,藏系品种主要分布于云贵高原,蒙古系则是品种种类最多分布最广的一支,在中国北部、中原地区及东部均有饲养;3大谱系的多重比较分析结果表明,蒙古系生产性能最好,藏系最差,哈萨克系居中;主成分分析表明通过结合前两个主成分1和2能将3大谱系区分开,可以推断出《羊志》中未明确谱系的地方品种,如大尾寒羊和广灵大尾羊为蒙古系,岷县黑裘皮羊为藏系;随后系统聚类分析又将地方绵羊品种划分3个类别并对肉用相关性状进行多重比较,根据每个类别的肉用相关性状特点分别命名为低产低繁组、高产低繁组和高产高繁组。其中高产高繁组包括7个地方品种,分别为小尾寒羊、多浪羊、大尾寒羊、洼地绵羊、太行裘皮羊、豫西脂尾羊和湖羊。【结论】挑选的绵羊相关表型信息可以用来辨别并推断未知谱系绵羊品种的谱系,未来可应用于新发现绵羊品种资源的分类。在42个地方绵羊品种中发现7个品种的生产性能接近于专门化肉用绵羊品种标准,是肉用绵羊培育或配套系杂交利用的理想材料。研究不仅是对中国地方绵羊遗传资源的再认识,也为研究《中国畜禽遗传资源志》的其他畜禽品种资源研究提供参考。     

鸡mir-1658前体基因多态性分析

【目的】研究鸡gga-mir-1658前体区基因遗传变异/单倍型及其在品种间的分布,分析其对microRNA二级茎环结构和靶基因选择的影响,旨在筛选其中具有潜在生物学功能的变异位点,为进一步揭示其对gga-mir-1658基因表达调控的影响及表型效应奠定基础。【方法】根据鸡gga-mir-1658基因组序列（GenBank登录号：NR_035151.1）设计一对特异性引物,采用PCR产物直接测序的方法,对太行鸡（95只）、北京油鸡（83只）和来航鸡（42只）3个鸡种220只个体的gga-mir-1658基因前体区进行多态性检测。使用DNAman、MEGA和mfold软件进行pre-gga-mir-1658基因组序列的比对分析和二级结构模拟。通过SHEsis软件和Haploview软件进行配对连锁不平衡分析和单倍型分析。使用miRanda软件对gga-mir-1658的靶基因及其复合物自由能变化进行预测分析。【结果】在pre-gga-mir-1658基因共发现6个变异位点,其中次要等位基因频率≥5％位点有g.28 C＞G、g.31 C＞T、g.70 G＞A和 g.71 G＞–,4个变异位点均定位于gga-mir-1658基因成熟体的种子区。遗传变异特征分析显示,g.70 G＞A 位点表现为低度多态（PIC＜0.25）,其余3个位点均表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.50）。适合性检验表明,除了来航鸡的g.31 C＞T、g.71 G＞–位点、太行鸡的g.71 G＞–位点以及北京油鸡的g.70 G＞A位点之外,其他变异位点在各鸡种均处于哈代-温伯格平衡状态（P＞0.05）。连锁不平衡和单倍型分析表明,各突变位点之间存在弱连锁平衡;从3个品种鸡中共检测到11种单倍型,其中H1（C C G –）和H11（G T G G）是群体的优势单倍型,频率均大于25%。生物信息学分析表明,种子区的突变可影响gga-mir-1658基因前体二级结构的空间构型和自由能,其中H6单倍型突变体的自由能最高（41.00 kcal·mol^-1）,H2和H5单倍型突变体的自由能最低（35.70 kcal·mol^-1）;群体的优势单倍型H1和H11突变体的自由能分别为-36.10和40.04 kcal·mol^-1。gga-mir-1658基因不同单倍型成熟体种子区序列存在差异,在gga-mir-1658-5p存在“AUACCAU”、“AUACCAC”2种种子区序列,gga-mir-1658-3p共有“AACUCUG”、“AGCUGUG”、“AACUGUG”和“AGCUCUG”4种种子区序列。针对gga-mir-1658的预测靶基因的生物信息学分析显示,它们主要在基因表达调控、细胞凋亡、免疫系统的发育和B细胞激活等基本生物学过程中显著富集;此外,种子区变化可以影响gga-mir-1658成熟体对靶基因的选择。【结论】（1）gga-mir-1658基因种子区存在4个具有潜在生物学功能和表型效应的突变位点,可组成11种单倍型,其中H1（C C G –）和H11（G T G G）在北京油鸡、太行鸡和来航鸡为优势单倍型。（2）种子区突变影响gga-mir-1658基因前体二级结构的稳定性和靶基因的选择,可能是具有潜在表型效应的重要功能位点。     

湖羊BMP7基因遗传多态、表达及与羔皮毛囊性状的关联

【目的】研究BMP7基因对湖羊不同花纹形成的影响及其与毛囊性状的发育可能存在的调控机制。【方法】利用PCR-SSCP方法在205个样本中检测BMP7基因外显子1、2、3的单核苷酸多态性;通过组织学方法和显微观察法对湖羊皮肤毛囊进行组织学观察,对不同花纹皮肤组织中初级毛囊直径、次级毛囊直径、初级毛囊数、次级毛囊数进行统计分析;利用荧光定量PCR技术检测BMP7基因在大花、中花、小花间的相对表达量,用SPSS17.0软件进行差异显著性分析,探讨BMP7基因对湖羊不同花纹形成及其毛囊性状可能存在的调控机制。【结果】PCR-SSCP方法检测BMP7基因外显子1、2、3的单核苷酸多态性,结果均未发现多态性;在组织切片分析中,湖羊大花初级、次级毛囊直径均大于中花、小花,小花初级、次级毛囊直径均介于大花、中花之间;大花次级毛囊数多于中花、小花,而小花次级毛囊数介于大花、中花之间。通过差异显著性分析可知,湖羊大花与中花、小花初级毛囊直径呈极显著差异（P＜0.01）,小花与中花初级毛囊直径差异不显著（P＞0.05）;中花次级毛囊直径与大花、小花次级毛囊直径呈极显著差异（P＜0.01）,但小花次级毛囊直径与大花次级毛囊直径差异不显著（P＞0.05）;初级毛囊数大花、中花、小花间差异均不显著（P＞0.05）,但相同视野中大花初级毛囊数多于中花、小花;中花次级毛囊数与大花、小花次级毛囊数呈极显著差异（P＜0.01）,但大花、小花次级毛囊数差异不显著（P＞0.05）;qRT-PCR结果显示,在同一时期BMP7基因在大花、中花中的表达量高于小花,且在大花、小花毛囊组织中表达量差异显著（P＜0.05）;BMP7基因相对表达量与小花初级毛囊直径呈显著正相关（P＜0.05）,与小花次级毛囊数呈极显著正相关（P＜0.01）,与中花初级毛囊直径和中花次级毛囊数呈显著负相关（P＜0.05）,这与组织学与显微镜观察的结果相符。【结论】未发现BMP7基因存在单核苷酸多态性,但BMP7基因表达量与毛囊部分指标存在相关性且与组织学观察结果相一致,可初步推测BMP7基因可能参与毛囊发育,调控被毛生长。     

内皮素3对不同毛色绵羊黑色素细胞的影响

【目的】探索内皮素3(EDN3)对来源于不同毛色体外培养的黑色素细胞产生黑色素作用机制及差异的影响。【方法】体外培养不同毛色皮肤来源的黑色素细胞,通过MTT法检测不同细胞在EDN3影响下的增殖率,分别提取两种细胞的总RNA和总蛋白,总RNA经反转录合成c DNA,采用实时荧光定量PCR方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在m RNA水平相对表达量的影响,总蛋白通过Western blot方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在蛋白水平的表达量是否发生变化,结果均使用SPSS19.0软件进行差异显著性分析。【结果】MTT法测得EDN3对黑白两种来源的黑色素细胞的增殖均产生促进作用,实时荧光定量PCR结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB m RNA的相对表达量是正常细胞组的1.7992倍,NRas是正常细胞组的1.8536倍差异极显著(P0.01),但TYR m RNA的相对表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB m RNA的相对表达量是正常细胞组的2.2512倍,NRas是正常细胞组的1.3859倍,TYR是正常细胞组的15.5710倍差异极显著(P0.01);Western blot结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.0827倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.2936倍差异显著(P0.05),TYR蛋白表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.9800倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.3658倍差异显著(P0.05),TYR是正常细胞组的1.8498倍差异显著(P0.05)。【结论】EDN3促进白色来源的黑色素细胞增殖但对色素合成的限速酶TYR未产生促进作用;EDN3促进黑色来源的黑色素细胞增殖并可能促进黑色素生成。