崂山奶山羊骨桥蛋白基因(OPN)部分片段多态性及其与生产性状的关联分析

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种分泌型糖基化磷蛋白,在介导骨组织细胞与骨基质的连接过程中发挥重要作用.为了加快奶山羊的遗传进展,为奶山羊生产性状的标记辅助选择提供理论依据,本研究利用DNA混合池技术和高分辨率熔解曲线分析技术,检测了崂山奶山羊(Capra hircus)泌乳母羊的OPN基因多态性,并采用最小二乘方法分析其与泌乳和生长性状之间的关联效应.在所有174只样本中共检测到2个SNPs,即位于第5内含子I355位点的C/T(以C/r表示)和第7外显子E341位点的C/T(以M/N表示),其多态信息含量(PIC)分别为0.2773和0.3267,其等位基因和基因型频率在育种场(F)和育种户(P)群体中的分布不均衡,I355位点的P群体偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05),其他均处于平衡状态(P＞0.05).在与泌乳性状的关联分析中,P群体除电导性状以外的所有性状表型值均极显著(P＜0.01)高于F群体;I355位点上,CC基因型个体的脂肪含量显著(P＜0.05)高于CT和TT基因型个体,灰分和冰点性状显著(P＜0.05)高于CT基因型个体；E341位点上,等位基因N为非脂肪物、乳糖率、乳密度、乳蛋白率、冰点以及灰分6个性状的有利等位基因,所有性状差异均不显著(P＞0.05).在与生长性状的关联分析中,F群体的体重和体长均极显著(P＜0.01)高于P群体；P群体的尻宽和尻长极显著(P＜0.01)高于F群体;I355位点上,TT基因型个体的体重极显著(P＜0.01)大于CC基因型个体；E341位点上,等位基因M为体高和胸围的有利等位基因,MM和MN基因型个体的体重和尻宽极显著(P＜0.01)高于NN基因型个体,MM基因型个体的体长极显著(P＜0.01)高于NN基因型个体,MM基因型个体的体高、胸围显著(P＜0.05)高于NN基因型个体.本研究发现OPN基因突变位点I355与乳中脂肪和碳水化合物的含量相关,突变位点E341与奶山羊的生长发育性状有显著的关联效应,可以作为奶山羊部分生产性状的分子遗传标记.     

奶山羊短链脂肪酸受体基因(GPR43)编码区(CDS)的克隆及表达分析

GPR43是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)家族成员之一,在脂代谢中具有潜在的调控作用。本实验旨在克隆奶山羊(Capra hircus)短链脂肪酸受体基因GPR43编码区(coding sequence,CDS)并分析其组织表达谱。根据GenBank上已登录的牛(Bos taurus)GPR43基因(NM_001163784)序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆奶山羊GPR43基因的编码区(coding sequence,CDS)(GenBank登录号:HM623658),测序结果分析表明,该基因CDS区长度为987 bp,共编码329个氨基酸。序列同源性分析表明,奶山羊GPR43的核苷酸和氨基酸序列与牛、人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)的相似性较高,且与牛的相似性高达90%以上。蛋白结构预测发现,奶山羊GPR43蛋白具有7个跨膜螺旋,且C端存在较强的疏水区域,N端则表现出较强的亲水性。实时定量PCR分析表明,在干奶期奶山羊的10个组织中,GPR43基因在脾脏中表达量最高,小肠、肝脏、脂肪次之,肺脏、肌肉和肾脏表达相对最少,而乳腺中也有少量的表达,表明其具有明显的组织表达特异性。泌乳期奶山羊GPR43基因的表达显著高于干奶期,表明该基因在奶山羊泌乳组织中具有一定的调控作用。研究结果为进一步揭示GPR43在奶山羊乳腺组织的功能提供参考资料。     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

奶山羊超长链脂肪酸延伸酶6基因(ELOVL6)的克隆及其对4个脂肪酸代谢基因表达水平的影响

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是长链脂肪酸延长反应的限速酶。本研究旨在通过对奶山羊(Capra hircus)ELOVL6基因的克隆、组织表达分析以及腺病毒(Adenovirus)介导的超表达技术,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响。利用RT-PCR技术克隆了奶山羊ELOVL6基因的CDS区;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在泌乳期奶山羊10个组织中的相对表达量;构建该基因的重组腺病毒超表达载体,包装出高滴度的腺病毒并感染奶山羊原代乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测ELOVL6超表达效果及其对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明,ELOVL6基因CDS区序列长度为795 bp(GenBank登录号:KF667508),共编码264个氨基酸。同源分析发现,奶山羊ELOVL6基因CDS区核酸序列与牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)和人(Homo sapiens)的同源性分别为97%、90%和93%,氨基酸序列同源性分别为99%、92%、95%。利用TMpred对ELOVL6蛋白跨膜结构预测分析,发现该蛋白有5个跨膜区,保守的组氨酸模体(HXXHH)位于ELOVL6蛋白的第二与第三跨膜螺旋间。ELOVL6蛋白质疏水性预测显示,该蛋白总体具有较强的疏水性。组织表达分析显示,ELOVL6基因在脂肪组织中表达量最高(P0.01),小肠次之(P0.01),心脏中表达量最低。超表达ELOVL6基因的重组腺病毒的滴度为108U/mL,病毒液感染原代乳腺上皮细胞48 h后,ELOVL6基因的表达量上升约200倍;脂肪酸代谢相关基因检测分析发现,固醇调节元件结合蛋白-1基因(SREBP-1)的表达量显著下降(P0.05),脂肪分化相关蛋白基因(ADRP)的表达量显著升高(P0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ)及脂肪酸转位酶基因(CD36)的表达量无明显变化。研究结果表明,ELOVL6基因可以影响奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢相关基因的表达,对乳腺脂肪酸代谢具有一定的调控作用。本研究为ELOVL6基因在奶山羊乳腺脂肪酸代谢调控中的功能研究提供研究依据。     

崂山奶山羊乙酰辅酶A羧化酶α基因(aCA CA)多态性及其与泌乳性状的相关分析

利用高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)和直接测序法,检测了174只崂山奶山羊(Capra hirc us)泌乳母羊的ACA CA基因启动子PⅢ位点多态性,采用最小二乘方法分析其与泌乳性状之间的关联效应.结果显示,在启动子PⅢ部分序列中共检测到3个SNPs,即第1206位的B/D,1255位的A/C和1322位的M/N,其等位基因和基因型频率在种羊场(F)和农户(P)两个群体中分布不均衡,均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05).在两个样本群中,大部分泌乳性状均存在显著的场别效应(P＜0.01或P＜0.05),而位点的基因型效应均不显著(P＞0.05).在F群体的1206位点上,等位基因B为乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物性状的有利等位基因,BB基因型与BD基因型的乳蛋白率和乳糖率性状差异极显著(P＜0.01),非脂肪物和乳密度性状差异显著(P＜0.05),乳蛋白率、乳糖率和非脂肪物性状均存在显著的等位基因替代效应(P＜0.05);而在P群体中,两种基因型之间的所有性状则差异不显著(P＞0.05).在F群体的1322位点上,等位基因N为乳糖率的有利等位基因,为300 d产奶量的不利等位基因,MN基因型与MM基因型的300 d产奶量和乳糖率性状差异显著(P＜0.01或P＜0.05),其等位基因替代效应分别为-52.22 kg和0.12％(P＜0.01);而在P群体中,等位基因M为乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物、乳密度的有利等位基因,基因型MM与MN在乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物和乳密度性状均存在显著差异(P＜0.05),乳糖率和非脂肪物的等位基因替代效应分别为-0.25％和-0.44％(P＜0.05).研究结果提示,ACACA基因启动子PⅢ相同等位基因在不同育种群体中,对乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物、乳密度、300 d产奶量存在不同程度的影响.     

家畜多能干细胞的研究现状与应用

多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括从胚胎内细胞团中分离出的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),外胚层干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs),从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离出的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs).这些细胞都具有向各种类型细胞发育的潜能,因此,PSCs为再生医学的发展,人类基因疾病的动物模型的建立,异种器官移植和高质量抗病新品种的培育提供了有效的途径.迄今为止,PSCs在小鼠(Mus musculus)模型和人类物种已经做了大量研究,同时,家畜的ESCs和iPSCs也取得了有效的进展,表明其不仅可以应用于特定家畜优良品性的稳定遗传和优育,而且可以以家畜为载体生产人类需要的化学药品和抗体,甚至应用在人类疾病的临床前应用中.然而,家畜的ESCs相对来说是难分离和富集的,体外培养建立稳定的ESCs系具有更大的难度和挑战.近年来,得益于对家畜ESCs和相关iPSCs相关的持续研究,已初步揭示了家畜ESCs的独特生物学特性.PSCs已经成为生命科学和高科技农业和生物学一个创新的研究领域.在本文中,本文综述了家畜PSCs的发展历程与应用前景.     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达及间接ELISA诊断方法的初步建立

根据猪圆环病毒2型（PCV2）LC株序列,设计合成3对引物,通过PCR扩增PCV2的3个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到pET-32a载体中,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,表达并纯化了重组蛋白。Western-blot分析表明,重组蛋白可以与PCV2阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白初步建立了间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为0．24μg／mL,血清最佳的稀释度为1：40。     

超临界CO2萃取生姜中抗氧化活性物质的工艺研究

随着天然抗氧化剂需求的增加,生姜中抗氧化活性物质提取的研究日益深入.本研究采用超临界二氧化碳(SC-CO2)萃取这一新型的分离技术对生姜中的抗氧化成分进行富集.通过生姜的含水率、粒度作为单因素,而对于影响萃取工艺的萃取温度、压力、时间三个因素进行正交试验分别进行了研究,同时以萃取量和添加到油脂中的过氧化值(POV)变化为指标,确定各工艺参数对萃取效果的影响.结果表明:应用10%以下含水率的片状生姜原料,采用60℃、24 MPa、140 min的操作工艺,可以获得较大量的具有较高抗氧化活性的生姜提取物.     

鸡DGAT2基因第7外显子多态性与生产性能的关联

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化真核生物甘油三酯合成最后一步反应的关键酶和限速酶,包括DGAT1和DGAT2两种.DGAT2对调节脂肪代谢、脂类在组织中的沉积及生长发育发挥重要作用.为研究鸡(Gallus gallus)DGA T2基因遗传多态性及其与生产性能的相关性,本研究以固始鸡×安卡鸡杂交F2资源群体(n=860)为研究材料,利用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测DGAT2基因的多态性,并分析多态性与生长性状、肉质性状、屠体性状、血液生化指标和肌纤维性状之间的关联性.结果显示,DGAT2基因第7外显子g.13955位置存在一个同义突变位点(C→T),PCR扩增产物被限制性酶Taq Ⅰ酶切消化后显示出CC、CT和TT三种不同基因型,基因型频率分别为0.49、0.48和0.03,等位基因A和B的频率分别为0.73和0.27.相关性分析显示,固始鸡×安卡鸡F2代个体初生重,2、4周龄体重、4、8周龄体尺指标及肌内脂肪含量在不同基因型之间差异显著(P＜0.05),CC基因型多数性状值显著高于TT基因型,对其他指标在统计学上无显著影响(P＞0.05).由以上结果可以推测,鸡DGAT2基因g.13955C＞T与生长发育有关,且C等位基因为优势基因,有望成为家禽品种选育的潜在DNA分子标记.     

西农萨能奶山羊脂联素受体1基因(AdipoR1)cDNA克隆、表达及功能分析

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)序列的同源比对结果,设计和合成PCR扩增引物,采用反转录PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Adipo R1的c DNA序列。结果显示,Adipo R1全长2 032 bp(Gen Bank登录号:HQ846828),包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1 128 bp,3’非翻译区(untranslated regions,UTR)719 bp和5’UTR 185 bp,该基因编码375个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,山羊与牛、猪(Sus scrofa)、小鼠和人的Adipo R1相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为42.44 k D,等电点为7.19,含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽。组织表达分析显示,该基因在肺中的表达量最高,小肠次之,在心脏中表达量最低,而其余8个组织中Adipo R1m RNA水平变化则比较平缓;奶山羊乳腺组织中Adipo R1表达量分析表明,Adipo R1的表达量在干奶期和泌乳盛期乳腺组织差异显著(P<0.05)。用不同浓度胰岛素(insulin)和催乳素(prolactin)处理奶山羊乳腺上皮细胞,结果发现,用胰岛素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量下调,在胰岛素浓度为50 nmo/L时效果最明显(P<0.01);用催乳素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 mg/m L时作用最明显(P<0.05),表明该基因在奶山羊乳腺上皮细胞中具有一定的调控作用。本研究为进一步揭示Adipo R1基因在奶山羊乳腺组织中的功能提供基础资料。     

绒山羊次级毛乳头细胞培养优化及miR-206对其调控研究

毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs),对毛囊再生具有诱导能力,并一定程度上决定毛囊的大小,在毛囊周期变化过程中发挥关键作用.本研究旨在优化陕北白绒山羊(Capra hircus)次级DPCs培养液体系,探讨miR-206对次级毛乳头细胞表达模式影响,分析miR-206与次级毛囊周期性发育关系,探索其在陕北白绒山羊皮肤毛囊发生过程中的作用.本研究采集陕北白绒山羊生长期皮肤样本,采用钝性分离与中性蛋白酶及胶原酶Ⅱ消化相结合的方法分离单根毛囊并剥离毛乳头;配制5组细胞培养液,利用细胞免疫荧光染色的方法检测毛乳头细胞中α-平滑肌激动蛋白基因(α-smooth muscle actin,α-SMA)和CD133的表达;利用脂质体3000介导miR-206模拟物转染次级毛乳头细胞,qRT-PCR检测7个与毛囊周期变化相关基因的表达情况.本研究成功进行了毛乳头细胞原代和传代培养,毛乳头细胞3d即可贴壁并伴有迁出;同时添加双抗、雌二醇(β2 estradiol,β2)、胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的培养液中毛乳头细胞从贴壁时间和迁出效率及细胞活力上均优于其他组,建议绒山羊次级毛囊生长期毛乳头细胞培养液为改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture F-12,DMEM/F12)(1∶1)、10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、双抗(100 IU)、β2(0.3 μg/mL)、ITS(5.0 μg/mL)、EGF(7.0 μg/mL).与对照组相比,miR-206转染毛乳头细胞后,蛋白络氨酸磷酸酶N1基因(protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 1,PTPNl)、骨形态发生蛋白2基因(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达量极显著升高(P＜0.01),BMP4表达量无显著差异(P＞0.05),与BCL-2相关的永生基因(BCL-2 associated athanogene 4,BAG4)、MAX二聚蛋白4基因(MAX dimerization protein 4,MXD4)、胰岛素样生长因子1基因(insulin like growth factor 1,IGF-1)和成纤维细胞生长因子受体2基因(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)表达量极显著下降(P＜0.01).经筛选分析BAG4可能是miR-206的候选靶基因.本研究成功对毛乳头细胞培养液进行了优化,转染的miR-206能够在绒山羊次级毛乳头细胞中稳定表达,初步判断其过表达对生长期毛囊的发育具有一定的抑制作用.本研究为进一步研究miR-206在毛囊周期发育中的分子机制提供了理论依据.     

西农萨能羊胰岛素诱导基因2(INSIG2)的克隆及组织表达分析

胰岛素诱导基因2(insulin induced gene2,INSIG2)是参与脂质形成和代谢调控的重要基因,而山羊乳腺中脂质合成和代谢与乳品质密切相关。为进一步明确它们之间的关系进而为改善山羊乳品风味提供科学支持。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR技术克隆山羊INSIG2基因,并采用实时荧光定量(RT-qPCR)技术在山羊10个组织中对INSIG2基因进行了组织表达分析。研究获得了915bp的cDNA序列(GenBank登录号:JQ361767),其中编码区678bp,该基因编码225个氨基酸,预测蛋白质分子量为24.8730kD,等电点(pI)为8.77。通过核苷酸和氨基酸序列比对分析发现,山羊的INSIG2与GenBank中牛(Bos taurus)的相似性最高。蛋白质结构分析显示,INSIG2存在6个跨膜螺旋;疏水性分析发现,其N端和C端均具有亲水性;遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪(Susscrofa)。INSIG2基因的组织表达分析表明,INSIG2基因在10个被检测组织中均有表达,且肺组织中表达量最高,肌肉次之,乳腺组织的表达量居中,心脏组织中最低。研究结果为该基因在山羊乳腺组织中的功能研究提供依据。     

山羊FGF1O基因的克隆及其表达分析

成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor 10,FGF10)是一种极其重要的生长因子,能促进小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)前体脂肪细胞的分化.为了获得山羊(Capra hircus)FGF10基因序列,研究其组织表达特性,确定其在肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,并分析FGF10mRNA表达水平与肌内脂肪沉积的关系,本研究以简州大耳羊(C.hircus)为实验动物,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆FGF10基因,采用Ⅱ型胶原酶消化获得山羊原代肌内前体脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测FGF10在成年山羊不同组织中的表达差异及其在肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达水平,并将基因表达水平与肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量进行关联分析.结果显示,克隆得到山羊FGF10基因(GenBank登录号:KT899958)序列1 252 bp,其中开放阅读框642 bp,编码213个氨基酸,与绵羊(Ovis aries)和牛(Bos taurus)的该基因同源性达100％,具有跨膜结构域和信号肽结构.FGF10 在山羊肺脏中表达水平最高,显著高于其他组织(P＜0.05),在脾脏和脂肪中也存在较高水平的表达.FGF10 mRNA在成年羊背最长肌中表达量显著高于羔羊与育成羊(P＜0.05),相关性分析结果显示,FGF10 mRNA表达量与山羊背最长肌IMF含量呈显著正相关(P＜0.05).FGF10 mRNA在肌内前体脂肪细胞中表达水平最低,在诱导分化后2d达到最高.本研究结果为进一步阐明FGF10基因在山羊肌内脂肪沉积中的分子机制提供了理论依据.     

绒山羊成纤维细胞生长因子5基因(FGF5)毛囊特异性表达载体的构建及转染胎儿成纤维细胞

绒山羊的绒毛品质、产量与皮肤毛囊的生长发育密切相关。本研究旨在构建绒山羊(Capra hircus)成纤维细胞生长因子5基因(fibroblast growth factor 5,FGF5)的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。分别以绒山羊基因组和c DNA为模板,利用PCR方法克隆角蛋白关联蛋白6-1(keratin associated protein 6-1,KAP6-1)基因的启动子和FGF5基因的编码区序列(coding sequence,CDS),并将这两个元件连接到去除CMV启动子的真核表达载体p EGFP-N1上,FGF5与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达框之间以猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)2A(P2A)相连,构建毛囊特异性表达载体p EGFP-N1-KF。表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞后,对细胞表达产物进行q RT-PCR和Western blot检测。酶切鉴定结果表明,载体p EGFP-N1-KF构建成功;q RT-PCR结果表明,FGF5正常表达;Western blot结果显示,P2A能够有效剪切FGF5和EGFP融合蛋白。表明成功得到了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体并在绒山羊胎儿成纤维细胞中能正常表达。本实验为进一步研究绒山羊FGF5基因在毛囊发育和周期调控中的作用提供了技术支持。