青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性研究

 【目的】通过分析青枯雷尔氏菌在不同寄主发病植株、在同一寄主不同侵染状态植株和同一寄主不同发病阶段植株体内分布及其致病力的异质性，从生态位角度来初步探讨该病原菌与植物之间的相互关系。【方法】采用田间采样，室内测定样本的含菌量及其病原菌的致病性（弱化指数），统计分析比较青枯雷尔氏菌在寄主植株体内的分布和致病力的异质性。【结果】番茄和茄子病株体内青枯雷尔氏菌的平均含菌量>100×108 cfu/g，显著高于烟草、花生和生姜（<70×108 cfu/g）。青枯雷尔氏菌的分布在番茄体内依次为根部>中部以上茎>中部以下茎；茄子和花生从根到上部茎依次含菌量逐渐降低；烟草根部和中部茎的含菌量显著高于下部和上部茎；生姜下部茎的含菌量显著高于姜块和中上部茎。不同寄主植物植株体内青枯雷尔氏菌的致病性差异显著，根据弱化指数的划分标准，平均弱化指数的大小依次为茄子>烟草>花生>番茄>生姜；生姜体内的青枯雷尔氏菌的平均弱化指数为0.49（<0.60），明显表现为强致病力，茄子体内的为0.80，接近于无致病力，烟草、花生和番茄为0.64～0.70，属于致病力不确定的菌株。茄子、生姜和花生的健康和发病植株检测的结果表明，仅有花生的健康与发病植株同时存在着青枯雷尔氏菌，而茄子和生姜健株无青枯雷尔氏菌侵染。【结论】青枯雷尔氏菌在不同寄主、不同发病状态、不同生育期植株体内的分布及致病力呈现明显的生态位分化的特征，了解这一特性对于青枯雷尔氏菌控制具有重要意义。     

芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上,鉴定结果表明:全部菌株属于生理小种1;25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明:来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等;来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此,江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。     

芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上,鉴定结果表明:全部菌株属于生理小种1;25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明:来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等;来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此,江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。     

青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法的研究

采用不同浓度的强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91处理番茄盆栽苗,建立青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法.结合菌落形态和特异性引物鉴定结果说明所分离得到的菌株均为强致病力青枯雷尔氏菌.当番茄植株培养至第5d时,4个不同接种浓度处理的番茄植株苗均出现发病症状.采用104 cfu·mL-1处理的番茄植株在第4d发病,但到第8d,...     

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

【目的】研究青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标“弱化指数（attenuation index,AI）”和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数（chromatography titer index, CTI_i）,CTI_i=S_i/（S₁+S₂+S₃）×100%（i=1、2或3;S₁、S₂和S₃分别对应P₁、P₂和P₃的峰面积）,测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTI_i值,用皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient,PCC）分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型：强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49-0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%-100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78-0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68-0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%-45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%-92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P₁（出峰时间为0.6 min）、P₂（出峰时间为4.4或4.5 min）和P₃峰（出峰时间为5.9或6.0 min）;强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型：单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P₃峰,无致病力菌株的主峰为P₁峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI₃为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI₃＜100%的菌株,接种后番茄植株发病率介于66.33%-84.14%;无致病力菌株中CTI₁达100%的菌株,其防治效果高,均达到80%以上,CTI₁＜90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%-63.62%;CTI₃与突变菌株致病力呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.62;CTI₁与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI₁可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI₃可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。     

青枯雷尔氏菌致病机制及其相关基因的研究进展

阐述青枯雷尔氏菌致病基因以及它们之间的相互调节。由于青枯雷尔氏菌的复杂性,进而发展了许多青枯雷尔氏菌分子鉴定技术,并且对青枯雷尔氏菌的鉴定逐渐走向快速、便捷和灵敏高的趋势。青枯雷尔氏菌基因组约5.8Mb,具有高(G+C)含量和约5 120个可能的编码基因;它是由3.7Mb的染色体和2.1Mb的大质粒所组成,主要的致病因子有Ⅲ型hrp分泌系统产物、胞外多糖、细胞壁降解酶(包括果胶质酶以及纤维素酶等),其涉及的基因主要包括hrp基因簇、avr基因、毒性基因;青枯雷尔氏菌通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)、II型分泌系统(T2SS)等分泌系统将多种毒性因子输送到胞外使寄主植物致病。同时,T3SS和T2SS之间也是相互影响的。上述致病因子的协调作用是由一个复杂的网络调节系统控制的,并以PhcA调节基因的启动和转录为核心,自动而精密地调节有关致病基因的表达及关闭,从而控制细菌的生长状态。     

青枯雷尔氏菌脂肪酸型与致病性的关系

 【目的】分析青枯雷尔氏菌脂肪酸种类变化与致病性指标-弱化指数和回接发病率的相互关系,提出青枯雷尔氏菌脂肪酸型种下分化的分类方法。【方法】青枯雷尔氏菌脂肪酸型分为：脂肪酸Ⅰ型,弱化指数＞0.8,回接发病率0%,属无致病力型;脂肪酸Ⅱ型,弱化指数为0.6～0.8,回接发病率为6.7%～100%,属过渡型,脂肪酸Ⅲ型,弱化指数＜0.6,回接发病率100%,属强致病力型。利用聚类分析、主成分分析、判别分析,分层筛选与脂肪酸型有关的脂肪酸种类.【结果】筛选出十四碳脂肪酸（X1）、十七碳脂肪酸（X9）,十八碳脂肪酸（X13）为主要因子,组建数据矩阵,建立脂肪酸型判别模型：Y1=-16.3353 + 0.0012X1 + 0.0056X9 - 0.0016X13,Y2= -3.4928 + 0.0002X1 + 0.0003X9 + 0.0025X13,Y3= -9.1550 - 0.0003X1 + 0.0039X9 + 0.0042X13,对于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔氏菌菌株,首先测定脂肪酸图谱,取出X1（十四碳脂肪酸）、X9（十七碳脂肪酸）、X13（十八碳脂肪酸）,代入方程,计算Yi,当1≤Yi≤2时,归为脂肪酸型Ⅰ,当2≤Yi≤3时,归为脂肪酸型Ⅱ,当Yi＞3时,归为脂肪酸型Ⅲ,模型的判别准确率达90.00%。【结论】青枯雷尔氏菌脂肪酸型的研究,为其种下分化建模的标准化和计算机自动分析方法的建立,提供可靠的基础。脂肪酸型的模型建立也为其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。     

福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

 【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析，比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布；对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析，分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成3类，即group Ⅰ、group Ⅱ和group Ⅲ；青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性：group Ⅰ为无致病性菌株，group Ⅱ为过渡性菌株，group Ⅲ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性；青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性，脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。     

茄子3株内生细菌分别与青枯雷尔氏菌混合培养特性研究

采用混合培养的方法,研究3株茄子内生细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,FJAT-943)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis,FJAT-946)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus,FJAT-964)与青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,FJAT-1305)数量消长动态。筛选优化培养基配方为:葡萄糖5g.L-1,酵母膏5g.L-1,蛋白胨10g.L-1。混合培养条件下,各菌株生长数量均低于单独培养。菌株FJAT-943和菌株FJAT-1305混合培养体系中,菌株FJAT-1305不能生长;菌株FJAT-946与菌株FJAT-1305混合培养3d,菌株FJAT-1305生长数量为7.40×109 cfu.mL-1,显著低于单独培养的9.78×109 cfu.mL-1;菌株FJAT-964与菌株FJAT-1305混合体系中,生长数量与单独培养均无显著差异。菌株FJAT-943、FJAT-946对菌株FJAT-1305具有显著抑制作用。     

青枯雷尔氏菌致病性的代谢组学异质性研究

采用基于LC/Q-TOF MS的代谢组学方法,对不同致病性青枯雷尔氏菌的胞外代谢物进行了分析,获得了具有显著性差异的代谢标志物,并采用PCA数据处理方法对不同致病性菌株进行分类,建立致病性的PLS-DA预测模型。结果表明,该方法可以从代谢水平上区分野生型强致病力菌株、野生型无致病力菌株以及强致病力菌株经Tn-5转座子插入导致致病力丧失的人工致弱突变菌株。对代谢标志物的差异分析结果表明,在无致病力菌株和Tn-5致弱菌株中,有12种代谢标志物与强致病力菌株具有显著性差异(P<0.05,FC≥2),并表现出相同的丰度变化趋势,预示着这些代谢标志物可能与青枯雷尔氏菌的致病性有关。     

烟草青枯菌Tn5突变体库的构建及突变位点分析

为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。     

利用无致病力青枯菌株防治番茄青枯病的研究

自发突变的无致病力番茄青枯菌株Ｔｍ３具有产生细菌素的能力,对番茄青枯菌株Ｔｍ４６有较强的抑菌作用,且能诱导烟草植株产生过敏性反应。盆栽和小区试验结果表明,Ｔｍ３具有较好的防治番茄青枯病的能力。防病机理可能是细菌素的抗生素和诱导植物抗病性的双重作用。     

茄科作物青枯病原菌的脂肪酸鉴定

 【研究目的】采用脂肪酸鉴定技术对茄科作物青枯病原菌进行鉴定,以期为青枯病的预防与防治提供技术支持。【方法】采用选择性培养技术对茄子、番茄和辣椒病株进行青枯病原菌的分离和纯化,而后对青枯病原菌进行脂肪酸鉴定。【结果】经选择性培养分离得到的36株青枯病原菌中,有33株鉴定为典型的青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）,占91.67%;茄子、番茄和辣椒上的青枯病原菌被鉴定为青枯雷尔氏菌的比例分别为100%、90%和89.47%。【结论】脂肪酸鉴定技术具有快速性、准确性,并可通过计算机的运用使分类达到数据化、自动化,可在茄科作物青枯病的检测中得到广泛的应用。     

应用计算机手段分析植物病原细菌Ralstonia solanacearum的蛋白质序列*

 应用SignalP 3.0，LipoP和TargetP对植物病原细菌Ralstonia solanacearum基因组中的3440个ORFs（open reading frames）进行了信号肽分析，同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明，3440个ORFs中有462个ORFs所编码蛋白质具有N-端有信号肽序列，其中348个分泌类信号肽、100个信号肽具有RR-motif信号肽，14个脂蛋白类信号肽，未发现Prepilin-like 信号肽和Bacteriocin and Pheromone信号肽。在这462个具有可切割信号肽的分泌蛋白中，有84.0%蛋白质为胞外分泌型（S型），13.2%为线粒体分泌型（M型），另外有2.8%为其它类型的分泌蛋白。通过LipoP分析该菌的全基因组预测具有4种类型蛋白质，其中其中SpI有425个，占12.3%；SpII有80个，占2.3%；CYT有2541个，占73.9%；TMH有414个，占12.0%。比较了Ralstonia solanacearum和Pseudomonas syringae pv. tomato信号肽的长度及氨基酸的组成，发现这两种菌在这些方面存在这很大程度的相似性。本研究通过对Ralstonia solanacearum进行分泌蛋白和信号肽结构的分析，为将来功能基因组和分泌型外源蛋白的利用提供理论基础。     

烟草青枯病菌生防菌的筛选和鉴定

采用纸碟片法筛选到4株对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有抑菌作用的生防菌C2c、C1a、Tsb和Ch1b,抑菌圈直径分别为51.50、25.95、24.40 mm和20.05 mm。通过16S r DNA序列分析,C2c、C1a和Tsb为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),Ch1b为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。这4株生防菌对烟草赤星病菌(Alternaria alternate)、烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苹果霉心病菌(Trichothecium roseum)等病原真菌也有较好的抑制作用。     

白肋烟青枯菌的分离鉴定及药敏性研究

[目的]分离鉴定白肋烟青枯菌并测定该菌对6种杀菌剂的药敏性。[方法]采用半选择培养基（PCCG）和聚合酶链式反应（PCR）技术相结合的方法,对四川省达州市白肋烟茎秆中的青枯菌进行分离,并对其生化型进行了鉴定;通过药敏试验,研究了所得青枯病菌在实验室条件下对叶枯唑、乙蒜素、农用硫酸链霉素、石硫合剂、47%聚赖氨酸、99%曲酸6种杀菌剂的敏感性。[结果]共分离得到23株青枯菌,均为生化Ⅲ型。分离所得青枯菌株对乙蒜素、农用硫酸链霉素、叶枯唑较为敏感,其中乙蒜素对烟草青枯病菌有良好的防治效果,其EC50为0.086 ml/L。[结论]为白肋烟青枯病的防治提供了理论依据。     

青枯雷尔氏植物疫苗菌60Co诱变菌株的生物学特性

利用60 Co辐射诱变青枯雷尔氏菌无致病力菌株FJAT-1458构建其突变体库,比较诱变后菌株与出发菌株在生长特性、防效、定殖方面的异质性。结果表明,60 Co诱变处理菌株的最佳剂量为200Gy,致死率达到92.5%。52株60 Co辐射诱变菌株中,有7株菌能提高对番茄青枯病的防治效果,为正突变,占13.5%;有11株菌的生防效果明显低于出发菌株的防治效果,负诱变率占21.6%,其中60 Co诱变后菌株FJAT-15022对番茄青枯病生防效果最好,在接种致病性青枯雷尔氏菌后第15d,对番茄青枯病防治效果达91.7%,明显高于出发菌株(83.3%)。60 Co诱变后菌株FJAT-15022的生长特性与出发菌株FJAT-1458不同,菌株FJAT-15022能在较高温度(40℃)正常生长,而出发菌株FJAT-1458在此温度下不能生长;二者的生长曲线不尽不同,主要表现在对数生长期,菌株FJAT-15022的生长速率大于出发菌株FJAT-1458,但差异未达显著水平。60 Co诱变后菌株FJAT-15022的定殖特性也与出发菌株FJAT-1458不同,菌株FJAT-15022的定殖时间比出发菌株FJAT-1458延迟5d,但出发菌株FJAT-1458的定殖数量高于诱变后菌株FJAT-15022。     

抗烟草青枯病菌的枯草芽孢杆菌SH7的筛选与鉴定

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的烟草青枯病是我国烟区的主要病害之一,严重影响烟草的产量和品质。从云南和贵州烟草青枯病重病区采集600份健康烟草根基土壤,并从中筛选出1株对R. solanacearum具有较强拮抗活性的细菌菌株SH7,该菌株在室内平板抑菌试验中,对R. solanacearum抑菌带宽可达132 mm。预先用SH7无菌发酵液保护烟株根部,对R. solanacearum防效达到66.0％。SH7发酵液经70％(NH4)2SO4饱和度沉淀并透析后得到的蛋白粗提液经平板抑菌活性检测,对R. solanacearum具有很强的抑菌活性,抑菌带宽为157 mm。初步确定SH7菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质。经菌体形态学、生理生化测定和16s rDNA序列测定,结果表明:SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

GFP标记的短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）转座突变株的构建初探

以水稻叶面附生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)为研究对象,通过构建pMOD-egfp-Tetr转座复合体,采用电击转化法对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的转化子。对转化子进行了遗传稳定性分析和分子鉴定,并且在荧光显微镜下观察到了强烈的绿色荧光,研究结果表明外源DNA已经成功整合进细菌的基因组中,gfp基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达。