甜瓜种子携带的镰刀菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到23个镰刀菌分离物。采用形态观察和分子生物学方法对其进行鉴定,并研究其致病性以及对甜瓜种子发芽的影响。通过观察菌落形态和色素颜色,以及大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形态,同时分析ITS-rDNA序列和翻译延伸因子-1α(TEF-1α)基因序列,以确定真菌分离物的分类属性。结果表明,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),5个分离物为层生镰刀菌(F. proliferatum),5个分离物为木贼镰刀菌(F. equiseti),9个分离物为轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)。这4种镰刀菌均对甜瓜幼苗有致病性,其分生孢子悬浮液对甜瓜种子发芽有抑制作用。这是我国首例开展甜瓜种子携带致病性镰刀菌的研究报道。     

甜瓜种子携带的镰刀菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到23个镰刀菌分离物。采用形态观察和分子生物学方法对其进行鉴定,并研究其致病性以及对甜瓜种子发芽的影响。通过观察菌落形态和色素颜色,以及大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形态,同时分析ITS-rDNA序列和翻译延伸因子-1α(TEF-1α)基因序列,以确定真菌分离物的分类属性。结果表明,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),5个分离物为层生镰刀菌(F. proliferatum),5个分离物为木贼镰刀菌(F. equiseti),9个分离物为轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)。这4种镰刀菌均对甜瓜幼苗有致病性,其分生孢子悬浮液对甜瓜种子发芽有抑制作用。这是我国首例开展甜瓜种子携带致病性镰刀菌的研究报道。     

贵州省黄果树旅游区柑橘叶斑病病原菌的鉴定与分析

柑橘叶斑病是黄果树旅游区柑橘重要产区和母本园区的重要病害,自2017年起对其进行了柑橘病害调查及病原菌鉴定,并从病害样品中分离、纯化了多个菌株,进行了菌落形态、子实体、产孢细胞、分生孢子和子囊孢子等形态的观察及分子生物学的鉴定。依据柯赫氏法则,在室内或自然条件下,研究了代表性菌株ZHGS-2017-010对柑橘叶片和果实的致病性。依据18S核糖体RNA基因(SSU)、核糖体内转录间隔区(r DNA-ITS1-5.8S-ITS2)、28S核糖体rRNA基因(LSU)、延伸因子-1α(EF-1α)和β-微管蛋白(β-tub),采用PAUP软件及最大简约法,进行了多基因系统发育树分析。结果表明,子实体为黑色,不规则球形。产孢细胞为圆柱形,淡蓝色或透明,大小为(42.5±5.3)μm×(4.4±1.0)μm。分生孢子,无色或淡蓝色、光滑、无隔膜,呈梭形或纺锤形,大小为(26.5±2.4)μm×(6.5±0.8)μm。基于SSU、ITS、LSU、EF1-α、TUB的系统发育树研究表明,代表性菌株ZHGS-2017-010与参考菌株Botryosphaeria dothidea CBS110302和CMW 800菌株在系统发育树上聚为一支,其自举支持率为91%,表明引起该地区柑橘病害的病原为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。致病性试验表明,代表性菌株ZHGS-2017-010可导致柑橘产生叶斑和果实腐烂。     

茶叶斑病病原菌茶拟盘多毛孢（Pseudopestalotiopsis theae）鉴定及生物学特性

从贵州省开阳县茶树叶部病害样品中分离纯化多个形态相似分离物,对其进行了菌落形态、子实体、产孢细胞和分生孢子等形态观察。依据内转录间隔区、部分28s大亚单位rDNA、翻译延伸因子1-α和微管蛋白基因,采用PAUP软件及最大简约法,进行了多基因系统发育树分析。在室内和自然条件下研究了代表性菌株AXLKY2019015对茶树叶片的致病性以及不同温度和pH等条件下该菌株的生长情况。结果表明,代表性菌株AXLKY2019015的菌落形态、子实体、产孢细胞和分生孢子等形态与茶拟盘多毛孢(Pseudopestalotiopsis theae)一致。多基因系统发育树分析表明,AXLKY2019015菌株与茶拟盘多毛孢(Ps. theae)的模式菌株MFLUCC12-0055在系统发育树上聚为一支,其自举支持率为100%。因此,初步确认菌株AXLKY2019015属于茶拟盘多毛孢(Ps. theae)。生物学特性研究表明,AXLKY2019015菌株在PDA培养基上生长最快,生长速率为(1.172 8±0.015 6)cm/d,显著高于OA和MEA培养基;在PDA培养基上最适生长温度为28℃,最适p H为7.0。致病性分析表明,AXLKY2019015菌株可在室内和自然条件下引起福鼎大白茶叶部产生病斑,符合柯赫氏法则。     

栗疫病菌表型特征的遗传分析

 本文对栗疫病菌的菌落形态、α-酯酶、β-酯酶及营养体亲和性(VC)特征进行了遗传分析。对有性后代的38个单子囊孢子菌株的研究结果显示:亲本菌株366与68的菌落形态、β-酯酶中(采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法)相对迁移率为2.17和2.33的2条酶带的遗传分别由1个位点上的2个等位基因控制;α-酯酶中相对迁移为2.54与2.772条酶带的遗传由相互连锁的2个基因位点控制;α-酯酶与β-酯酶间存在完全连锁关系;菌株366与68之间至少存在4个VC基因差异。     

重庆地区辣椒疫霉菌的分离培养及生理小种鉴定

本试验分离鉴定了来源于重庆不同辣椒产区的14个病原菌分离物,经形态特征鉴定及回接发病特征观察,确定这些菌株均为辣椒疫霉(Phytophthora capsici)。14个菌株在OMA培养基上诱导产生的孢子囊形态类似,形状多为卵圆形或长椭圆形,乳突明显。对PDA、OMA、CA及V8汁4种培养基上的培养性状观察表明,辣椒疫霉菌株在OMA培养基上生长速度最快,但在V8汁培养基上产孢最多。采用灌根法对14个菌株进行生理小种鉴别,其中10个为race 3,2个为race 2,2个为race 1,初步推定race 3为重庆地区辣椒疫病病原菌的优势小种。     

贵州省白及叶褐斑病病原菌鉴定及其生物学特性

为明确贵州省白及叶褐斑病病原菌及其生物学特性,采用组织分离法和离体接种法分别对其病原菌进行分离和致病性测定,利用形态学及ITS、EF-1α、β-tubulin基因序列分析对病原菌的分类进行鉴定,并对病原菌的生物学特性进行研究。结果表明:分离得到的白及叶褐斑病病原菌菌株编号为HGUP_(17)355;该菌菌丝白色、羊绒状,菌落中心隆起呈淡黄色、背面枫叶红色,大型分生孢子窄镰刀形,3～8个分隔,未见厚垣孢子,小型分生孢子卵圆形,1～2个分隔;在以ITS、EF-1α、β-tubulin三个基因序列构建的系统发育树中,菌株HGUP_(17)355与燕麦镰刀菌Fusarium avenaceum聚于一支,且支持率达100%,结合形态特征与分子生物学将其鉴定为燕麦镰刀菌。该菌菌丝最适生长温度为20℃,最适生长pH为6,在燕麦片琼脂培养基上生长最快,以麦芽糖为碳源、以L-苯丙氨酸为氮源时利用率最高,致死温度为45℃,对光照不敏感。     

玉米穗腐病样品中层出镰刀菌的分离与鉴定

为了解豫西南玉米穗腐病的病原菌,于2009年9月在河南省南阳市6个县区采集玉米穗腐病样品,进行病原菌的分离与单孢纯化.依据致病性、形态及分子检测结果进行病原菌鉴定.研究结果表明,分离得到的105株镰刀菌中,层出镰刀菌Fusarium proliferatum为70株,占分离镰刀菌的66.7％,属优势种群.在基于核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS)与翻译延长因子1α基因(tef)序列构建的系统发育树中,3株代表菌株Fp1、Fp2和Fp3分别与GenBank登记的层出镰刀菌在自举值89％和91％水平相聚同一群.层出镰刀菌的生长温度为13～34℃,最适温度为28℃;在pH5.0和6.0各有1个生长高峰;碳源对该菌营养生长的影响较为稳定,而氮源对其营养生长影响的变幅较大.     

引起我国甜樱桃叶斑病的间座壳菌种类鉴定

为明确引起我国甜樱桃叶斑病的病原菌种类,于2019年在北京市、四川省、山东省和辽宁省对与已报道的其他叶斑病症状明显不同的一种甜樱桃叶斑病进行调查并采集病叶,通过组织分离法进行病原菌分离纯化,结合形态学特征和多基因(ITS、EF1-α、TUB2和CAL)系统发育分析对病原菌的种类进行鉴定,并采用离体叶片接种法进行致病性测定。结果显示,新发现的这种甜樱桃叶斑病通常从叶边缘产生圆形或不规则灰褐色病斑,病斑周围具黄色晕圈,有时形成穿孔。从病样中共分离纯化得到10株单孢系菌株,结合其菌落形态、分生孢子形态和大小等,以及多基因系统发育分析结果,最终将10株菌株鉴定为甜樱间座壳Diaporthe eres(5株)和大豆间座壳D. sojae(5株),致病性测定结果显示甜樱间座壳和大豆间座壳对甜樱桃叶片均具有致病性,完成柯赫氏法则验证。     

江西瑞昌山药炭疽病菌的形态及分子鉴定

为了明确江西瑞昌山药炭疽病病原菌种类归属,本文从当地采集呈典型症状的炭疽病叶片进行了病原菌分离鉴定.通过组织分离获得8个在培养性状和分生孢子形态大小均一致且均具有致病性的分离株,8个分离株在PDA平板上菌落初为白色,后变为灰色至深灰色,菌落中央产生橘红色黏质分生孢子团.分生孢子无色,长椭圆形至纺锤形,单胞,大小为(15.6~18.0)μm×(3.6~6.0)μm.对其中之一的分离株YRRC-1进行rDNA-ITS区段扩增和序列测定,获得长度为536 bp的rDNA-ITS序列,该序列与胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的对应序列同源性达100%.根据分离病菌的培养特征、形态大小和序列鉴定结果,认为瑞昌山药炭疽病菌属于胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides).     

荷花腐败病病原菌的形态学与多基因分子系统学鉴定

荷花(Nelumbo nucifera)是我国十大名花中唯一的水生花卉,在珠三角等湿地广泛栽培。近年来,荷花栽培集中区,大范围发生腐败病,影响了正常的生产与旅游观光产业,为了有效控制病害发生蔓延,生产上急需明确荷花腐败病的病原。本研究通过病原菌致病力测定、形态比较、分子特异检测,以及基于翻译延伸因子(TEF-1α)、rDNA基因内间隔区(IGS)、线粒体小亚基(mtSSU)等基因片段的系统发育分析,对采自广东、广西、江西、福建、湖南、湖北等地的荷花腐败病病原菌进行鉴定及系统发育研究,结果如下:(1)形态学与分子鉴定均表明荷花腐败病菌为Fusarium commune,该菌为尖孢镰孢菌(F.oxysporum)的近缘种,首次在荷花上报道。(2)F.commune与尖孢镰孢菌(F.oxysporum)在形态上非常相似,F.commune能产生长度大于25μm的细长形单瓶梗及偶尔产生复瓶梗的形态特征,区别于F.oxysporum。MtSSU、EF-1及IGS等基因位点可用于F.commune和F.oxysporum这两个种的明确区分。(3)我国不同地区的荷花腐败病菌存在一定的遗传分化,荷花腐败病菌与分离自我国的荸荠枯萎病菌(Fusarium commune)为同一个种。     

苦皮藤素类似物的合成与结构鉴定

以苦皮藤Celastrus angulatus Max.提取物水解产物中的多羟基β-二氢沉香呋喃为原料,合成了对粘虫Mythimna separata具有毒杀活性的苦皮藤素(Celangulin)类似物,并在活性追踪的指导下分离得到了两个具有杀虫活性的苦皮藤素类似物 A和B, 其结构经核磁共振谱、快原子轰击质谱、高分辨质谱等波谱学方法鉴定为2β,6α,8β,13-四异丁酰氧基-1β,4α,9α-三羟基-β-二氢沉香呋喃及1β,2β,6α,8β,13-五异丁酰氧基-4α,9α-二羟基-β-二氢沉香呋喃。化合物 A和B 均为新化合物,在20 mg/mL的浓度下对三龄粘虫Mythimna separata的胃毒活性(死亡率)分别为89.5%和93.2%。     

宁夏马铃薯黄萎病病原菌分离鉴定及寄主范围测定

 为明确引起宁夏马铃薯黄萎病病原菌种类,本试验通过常规组织分离法对采自宁夏马铃薯主栽地区固原和西吉的27株马铃薯黄萎病标样进行了分离,共获得11株分离物。采用形态学并结合肌动蛋白(ACT)、延伸因子-1α(EF1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、色氨酸合成酶(TS)的多基因系统发育分析方法,11株分离物均被鉴定为非苜蓿轮枝菌(Verticillium nonalfalfae)。致病性测定结果表明,该轮枝菌能够侵染马铃薯植株幼苗并引致典型的黄萎病症状。非苜蓿轮枝菌对茄科、菊科、豆科、十字花科、葫芦科和锦葵科等6科13种双子叶作物的致病性测定结果表明,其对西葫芦、黄瓜、茄子、烟草、豇豆、棉花和向日葵的致病性强,对番茄、辣椒、生菜和白菜致病力弱且发病缓慢,对西蓝花和苜蓿无致病性。     

河南省玉米茎基部镰刀菌的形态和分子鉴定

 为明确河南省玉米茎基部镰刀菌(Fusarium spp.)的种群组成及分布, 2011和2012年, 我们采集了河南省14个地市42个县(区)的玉米茎基腐病病样, 分离得到163个镰刀菌单孢菌株。首先对菌株进行了形态学鉴定, 在此基础上使用镰刀菌种特异性引物进行了PCR检测;对于部分PCR检测未能确认的菌株进行了Translation elongation factor 1-α(TEF-1α)基因片段测序及BLAST分析, 最终将163个菌株鉴定到种。结果表明在163个菌株中, 禾谷镰刀菌F. graminearum为优势种, 占44.2%(72株), 其次为层出镰刀菌F. proliferatum和轮枝镰刀菌F. verticillioides, 分别占28.8%(47株)和27.0%(44株)。豫西北的焦作(47.6%)、洛阳(50.0%)及豫中的许昌(45.5%)均以F. verticillioides为主, 豫东的商丘(42.9%)、开封(57.1%)以F. proliferatum为主, 豫北的安阳(66.7%)、濮阳(71.4%)、新乡(62.5%)和豫南的南阳(57.1%)、驻马店(45.0%)以及中部的郑州(57.1%)、漯河(66.7%)则均以F. graminearum为优势种。     

三七根结线虫病在云南发现

 根据寄主反应和血清学试验将我国分离的16个黄瓜花叶病毒(CMV)分离物及4个标准毒株(Fny、Lny,M和WL)区分为两个亚组。14个分离物及标准毒株Fny、M属亚组IDTL血清组,2个分离物及标准毒株Lny、WL属亚组ⅡToRS血清组。选用9科23种(或品种)植物进行寄主反应测定,发现茄科的心叶烟(N.glutinosa)、普通烟(N.tabacum cv.Xainthi-NC)及葫芦科的西葫芦(Cucurbita pepo)能将两亚组分离物区分开。采用法国和美国提供的8个单克隆抗体进行单、多克隆抗体夹心ELISA测定,能区分两亚组的分离物,首次证实在我国存在两个亚组的CMV分离物。     

华北地区十字花科芸薹属蔬菜上立枯丝核菌的病原生物学研究

 由丝核菌引起的十字花科蔬菜叶腐和茎基腐病在中国华北地区普遍发生,其中以河北、内蒙以及北京较为严重。2011~2018年,从华北地区不同省份具有典型叶腐和茎基腐症状的芸苔属蔬菜上分离获得95个丝核菌(Rhizoctonia spp.)分离物,大多数分离自发病植株的叶部,少数分离自茎基部。通过细胞核染色,87株菌属于多核丝核菌,另外8株属于双核丝核菌;经菌丝融合鉴定、rDNA-ITS区及TEF-1α(translation elongation factor 1-alpha, TEF-1α)序列分析,大多数多核丝核菌属于立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-2-1(74％),其他少数分别属于AG-1-IB(16％)、AG-4-HG II(2％)和双核丝核菌AG-A(8％)。温室条件下进行寄主范围致病力测定,各分离物对原寄主都表现出致病力,呈现典型叶腐或茎基腐症状;对其他作物的致病力差异较大。不同融合群(Anastomosis group,AG)的菌株对寄主致病力大小存在差异,AG-2-1致病力最强,只有AG-A对叶部没有致病力。AG-2-1对寄主叶部的致病力和对茎基部的致病力呈显著正相关,AG-1-IB对寄主叶部的致病力和对茎基部的致病力无显著相关性。     

华北地区十字花科芸薹属蔬菜上立枯丝核菌的病原生物学研究

 由丝核菌引起的十字花科蔬菜叶腐和茎基腐病在中国华北地区普遍发生,其中以河北、内蒙以及北京较为严重。2011~2018年,从华北地区不同省份具有典型叶腐和茎基腐症状的芸苔属蔬菜上分离获得95个丝核菌(Rhizoctonia spp.)分离物,大多数分离自发病植株的叶部,少数分离自茎基部。通过细胞核染色,87株菌属于多核丝核菌,另外8株属于双核丝核菌;经菌丝融合鉴定、rDNA-ITS区及TEF-1α(translation elongation factor 1-alpha, TEF-1α)序列分析,大多数多核丝核菌属于立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-2-1(74％),其他少数分别属于AG-1-IB(16％)、AG-4-HG II(2％)和双核丝核菌AG-A(8％)。温室条件下进行寄主范围致病力测定,各分离物对原寄主都表现出致病力,呈现典型叶腐或茎基腐症状;对其他作物的致病力差异较大。不同融合群(Anastomosis group,AG)的菌株对寄主致病力大小存在差异,AG-2-1致病力最强,只有AG-A对叶部没有致病力。AG-2-1对寄主叶部的致病力和对茎基部的致病力呈显著正相关,AG-1-IB对寄主叶部的致病力和对茎基部的致病力无显著相关性。     

稻瘟菌群体中dsRNA的多样性及稻瘟菌菌株QSP5中病毒对寄主生物学性状影响的研究

 真菌病毒在真菌中广泛存在,一些真菌病毒可以影响病原真菌营养生长、产孢和色素形成等性状。本文研究了真菌病毒在水稻稻瘟菌中的多样性以及其对寄主生物学性状的影响。采用单孢分离的方法从发病水稻叶片上分离获得了120个稻瘟菌菌株,其中约52%携带dsRNA片段。菌株QSP5被2个基因组为dsRNA的病毒即产黄青霉病毒1-C(Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-C, MoCV1-C)和稻瘟菌病毒3(M. oryzae virus 3, MoV3)所侵染。对菌株QSP5进行单个的分生孢子纯化,获得了仅携带MoV3的菌株QSP5-9。菌株QSP5与QSP5-9的产孢量、菌丝形态以及菌落形态存在明显差异,经研究推测MoCV1-C与菌株QSP5 的产孢能力衰退、菌丝生长和产色素异常相关。同时对MoV3的稳定性进行了初步的研究。从稻瘟菌菌株QSP5获得了100个单孢分离物,通过对随机挑选的40个单孢分离物进行检测,结果表明这些分离物100%携带MoV3,只有部分单孢分离物携带MoCV1-C。另外,从稻瘟菌菌株QSP5-9获得了94个单孢分离物,对随机挑选的45个单孢分离物进行检测,结果表明这些分离物中均含有与菌株QSP5-9大小相同的dsRNA片段。根据以上结果推定MoV3在稻瘟菌菌株QSP5和QSP5-9及其无性后代中具有一定的稳定性。     

花生白绢病菌ITS分型、菌丝亲和群分析及相关生物学特性比较

2013~2016年从全国12个省市采集不同花生白绢病样本,共分离获得39个分离物,对其ITS-r DNA序列进行了分析,表明它们均属于齐整小核菌(Sclerotium rolfsii);这39个分离物分为两个亚组,分别包含22个和17个菌株;对这39个菌株进行了菌丝亲和群分析及相关生物学特性比较,共鉴定出23个菌丝亲和群;8个亲和群包含2~6个菌株,其余的15个亲和群都只包含1个菌株;同一菌丝亲和群的菌株菌落形态相似,大多数菌株的菌丝生长速度、菌核大小比较相近,个别菌株差异较大;39个菌株均能产生草酸,在菌落形态、菌丝生长速度、菌核大小和重量上均有差异,生长速度为0.47~2.32cm·d~(-1),菌核直径为0.71~1.87 mm,单粒菌核干重为0.24~2.64 mg。     

绿僵菌属4个生防潜力菌株的多基因鉴定

传统的绿僵菌分类鉴定以形态特征为主要依据,其局限性使种内仍包含着复杂的类群。DNA分子鉴定使绿僵菌属、种分类更为细化和准确,对其育种、杀虫机理、生态学等的研究非常重要。本文对绿僵菌4个有生防潜力的菌株IPPM010202、IPPM2029、IMI330189和M200614的5个持家基因即核糖体转录间隔区序列(ITS1-4)、β微管蛋白(beta-tubulin)、RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB1)、RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基(RPB2)和翻译延伸因子(EF-1α)的同源序列进行了克隆和测序,通过构建系统发育树进行了多基因进化分析。结果表明,4个生防菌株分别位于进化树的3个分支上,鉴定菌株IPPM010202和IPPM2029同属于平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense,IMI330189为蝗绿僵菌M.acridum,M200614属于低温绿僵菌M.frigidum,它们之间亲缘关系很近,5个基因的遗传分化距离只有0.021~0.036。ITS1-4序列有较高变异频率和变异幅度,分类效率优于其他基因;EF-1α序列在鉴别菌株和分析亲缘性上有优势。多基因的系统进化分析能够弥补单基因分析的局限,取得更为准确的鉴定和更为细化的分类结果。