表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用

塞内卡病毒A（SVA）是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20 μmol·L^-1的姜黄素和110 μmol·L^-1黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。     

表达绿色荧光和红色荧光蛋白重组新城疫病毒的构建

试验旨在探究以新城疫病毒为载体进行多联疫苗的构建.通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(DsRed)基因用T2A肽串联后克隆入嵌合新城疫病毒AI4-2FHN的P和M基因之间,获得重组质粒pAI4-2FHN-GRFP.该质粒与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助质粒共转染至稳定表达T7 RNA...     

表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

为确定狂犬病病毒(RV)Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法,本研究在建立了RVFlury-LEP株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP,并成功拯救出重组病毒(rLEP-EGFP)。rLEP-EGFP的生物学特性和野生型LEP(wtLEP)在NA细胞和BHK-21细胞中的生长动力学及对小鼠的致病性没有显著差异。rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,各代次重组病毒均稳定表达EGFP。重组表达的EGFP可用于中和抗体检测,rLEP-EGFP免疫犬血清经间接免疫荧光(IFA)或荧光下直接观察检测RV中和抗体滴度,两种检测结果显示较好的相似性(p0.05)。本研究为研制以Flury-LEP株活载体多价疫苗奠定了基础,并为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法。     

表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建

通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度生长特性,细胞连续传代10次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。本研究为VSV作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。     

共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

禽偏肺病毒Taqman荧光定量PCR方法的建立及应用

根据Gen Bank中a MPV-C P基因序列,设计出一对特异性引物和Taqman探针,建立了a MPV-CTaqman探针荧光定量PCR方法。对该反应体系进行优化,进行特异性、敏感性及重复性试验,并且建立标准曲线。结果表明,该方法只对a MPV-C检测为阳性,具有良好的特异性;能够检测到(3.63×102)拷贝数,具有良好的敏感性;建立的标准曲线斜率为-3.312,截距为44.66,相关系数为R2=0.999,循环阈值和模板拷贝数具有良好的相关性,组内及组间重复性好。采用a MPV-C Taqman探针荧光定量方法、普通PCR方法对来自广东、浙江地区25份番鸭疑似阳性a MPV-C的病料进行检测,其中前者23份阳性,后者18份阳性。这表明a MPV-C Taqman荧光定量PCR方法对样品的检测具有特异性和敏感性高的特点,更适合临床样品的检测。     

表达绿色荧光蛋白的鸭肠炎病毒gE基因转移载体构建

本实验利用PCR方法扩增DEVC-KCE株gE基因片段(包含gI基因及其侧翼序列),扩增产物克隆入pGEM-T载体测序后亚克隆至pUC19 EcoRI、SalI位点间,获得pUC-gE。将增强型绿色荧光蛋白表达盒插入pUC-gE BamHI位点,构建转移载体pUC-gE-EGFP。该转移载体有7个单一酶切位点可供外源基因插入,上下游侧翼分别为1.57Kb和1Kb。将转移载体pUC-gE-EGFP转染鸭胚成纤维细胞(DEF),观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得有效表达,为开发以鸭肠炎病毒为载体的多价、多联基因工程疫苗提供了物质基础。     

携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猫泛白细胞减少症病毒（feline panleukopenia virus,FPV）,以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和Nhe Ⅰ酶切位点,然后用AgeⅠ和Nhe Ⅰ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4 ℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞（F81）,利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。     

表达绿色荧光蛋白的MVA重组毒株的构建及筛选

为了构建及筛选表达绿色荧光蛋白（GFP）的改良型痘苗病毒安卡拉（MVA）重组毒株,并对其进行鉴定,本研究基于同源重组原理设计引物,通过PCR扩增获取含有MVA两侧同源臂的外源基因GFP片段,将GFP基因片段转染到感染了MVA的CEF细胞中使之同源重组到MVA ORF086-087位点（基因组中70303-70304 bp之间）,利用倒置荧光显微镜观察并标记表达GFP的单个噬斑,筛选获取重组毒株,应用倒置荧光技术、PCR及Western blotting对该重组毒株进行鉴定。结果显示,经过3轮噬斑筛选,在倒置荧光显微镜下可观察到大量表达GFP的单个噬斑,PCR扩增检测结果表明目的基因已成功整合到重组毒株MVA-GFP中。Western blotting结果表明,GFP在感染的细胞内成功表达。本研究利用基因工程技术成功获得表达GFP的重组毒株MVA-GFP,可为进一步将其他抗原基因插入GFP位点中筛选无标记的重组毒株及疫苗研究提供材料。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒的拯救

对现地分离的4株H9亚型禽流感病毒HA基因进行序列测定,选取其中1株在新城疫病毒 La Sota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达H9亚型禽流感病毒野生型HA基因的重组新城疫病毒基因组cDNA克隆,经间接免疫荧光和RT-PCR鉴定,结果表明:拯救重组病毒为rL-H9HA;重组病毒MDT≥168 h,ICPI和IVPI均为0,与亲本疫苗株La Sota具有相似的生长特性;重组病毒保持了La Sota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性,具有作为同时预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景.     

重配H9N1亚型流感病毒感染性克隆的构建及鉴定

为了研究禽流感病毒的反向遗传,试验采用霍夫曼发明的8质粒拯救系统,将分离得到的AIV Isolate3(H9N2)基因组,通过RT-PCR得到HA基因,并克隆到以pcDNA3质粒为骨架自行构建的双向转录/表达载体pHW2008上,得到HA转录/表达质粒,再将HA表达质粒与构建好的包含A/Puerto Rico/8/34(H1N1)7个内部基因双向转录/表达质粒共转染人肾上皮细胞(293T)与犬肾细胞(MDCK)混养细胞。结果表明:试验成功构建了重配H9N1亚型流感病毒减毒株。     

鹅源副黏病毒NA-1株反向遗传操作体系的建立

应用cRACE等方法扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA5′末端和3′末端,分6段扩增得到病毒的结构基因序列,而后连接本室构建的TLH-T转录载体,构建其cDNA全长克隆。在引入分子标签和验证辅助质粒的功能后,4质粒系统共转染VT7细胞系,成功拯救出了具有感染性的鹅副黏病毒。鹅源副黏病毒NA-1株反向遗传操作体系的建立为进一步深入研究该病毒基因组的功能以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

表达猪流行性腹泻病毒纤突蛋白的重组水泡性口炎病毒构建和鉴定

为表达猪流行性腹泻病病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)纤突蛋白,利用Mega7基于PEDV纤突蛋白氨基酸序列进行遗传进化分析,选择新发流行毒株纤突蛋白基因,以重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体,在rVSV_MT基因组G和L间插入目的基因,通过反向遗传学技术拯救VSV_MT-S△19重组病毒,Western blot和RT-PCR鉴定重组病毒是否成功表达PEDV纤突蛋白,采用一步生长曲线鉴定VSV_MT-S△19在Vero细胞中的生长特性,并与弗氏佐剂混合后肌肉注射小鼠探究其在动物体内的免疫效果。遗传进化分析发现,插入rVSV_MT的纤突蛋白基因序列PEDV/CHN/SH-2012-5属于PEDV新发流行毒株GⅡ型; RT-PCR分析重组病毒表达纤突蛋白基因无突变; Western blot鉴定显示出PEDV纤突蛋白和VSV病毒特征条带;一步生长曲线表明重组病毒VSV_MT-S△19体外复制滴度可达108TCID50/m L,与VSV_MT-GFP无显著性差异(P> 0. 05);小鼠动物试验结果表明,重组病毒成功激发PEDV中和抗体产生,与对照PBS接种组差异显著(P<0. 05)。研究表明,利用重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体表达GⅡ型PEDV纤突蛋白能有效激发机体产生高水平中和抗体,为PEDV亚单位疫苗的研制提供了理论和实践依据。     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。