甘薯羽状斑驳病毒分离物的基因组3′-末端序列测定与分析

采用马铃薯Y病毒属通用引物,从甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)山东济南分离物和浙江杭州分离物基因组3′-末端扩增到一个含1814个核苷酸的序列,序列号分别为AJ310201和AJ310202.两个序列均包括NIb基因部分序列(nts 1-645)、外壳蛋白基因(nts 646-1590)和3′-UTR (nts 1594-1814),3′-末端具有典型的 poly(A)尾.外壳蛋白基因核苷酸系统进化树分析和氨基酸分析表明,以前对一些SPFMV分离物的命名有待商榷,一些相关性较强的分离物可分为3个进化主要群体,我国两个分离物属于第二群体.     

甘薯羽状斑驳病毒RT-PCR检测

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列设计并合成特异性引物,建立SPFMV的RT-PCR检测程序。特异性和重复性实验结果表明,该方法能够检测SPFMV,具有很好的特异性和重复性。并对PCR产物进行测序鉴定,结果与报道的序列同源性为88.3%和98.6%,证实所扩增的片段是病毒基因的部分片段。     

甘薯羽状斑驳病毒分子生物学研究概况

近些年来甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）分子生物学有了较深入的研究。如整个基因组的全序列、整个基因组作为一个可译框架（ORF）的某些精细结构和特点、各个功能蛋白的结构和功能（如蚜传机理）、基因组组分与其它马铃薯Y病毒属（PVY）成员的同源性比较、该病毒在PVY属病毒成员的分类地位等都有所涉及。了解这些为利用分子生物学手段对赢余中病毒进行鉴定、检测和加强抗SPFMV病毒基因工程的研究，开辟甘薯等抗病毒育种新途径具有重要意义。     

甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)O株系中国分离物(SPFMV-O-Ch1)和RC株系中国分离物(SPFMV-RC-Ch1)的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10 922和10 851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10 557和10 ...     

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)生物学性状研究

经 1996～ 1999年研究 ,明确了侵染甘薯的甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)的失毒温度为 6 0～ 6 5℃ ,稀释限点为 10 -3 ～ 10 -4 ,体外保毒期为 1天 ,用 2 3种植物测定表明 ,SPFMV侵染普通牵牛和巴西牵牛 ;桃蚜、棉蚜、豆蚜、绣线菊蚜均为SPFMV传毒介体 ,白粉虱不传。免疫电镜观察 ,SPFMV质粒线条状 ,长度 830～ 85 0nm。制备的SPFMV抗血清效价为 1∶10 2 4。     

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

[目的]以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯G病毒（Sweetpotato virusG,SPVG）基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障.[方法]根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系.[结果]分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97％,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99％.分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象.以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致.[结论]用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测.     

甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒双重 RT-PCR 检测方法的建立

根据 GenBank 中公布的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）外壳蛋白（CP ）基因和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）热激蛋白（Hsp70）基因序列保守区域设计了2对特异性引物,通过 RT-PCR 反应程序的优化,建立了能同时检测 SPFMV 和 SPCSV 的双重 PCR检测体系。该检测体系能够1次扩增出 SPFMV 和 SPCSV 的特异性片段,片段大小为461 bp 和304 bp,测序结果表明,2种病毒序列与参考序列的同源性达93％以上。     

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,提高检测灵敏度,实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物,采取单因素优化试验,对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg²⁺、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化,恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析,SYBR Green I可视化显色,结果表明：SPFMV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3 0.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO₄ 1.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3...     

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin,UBI）和组蛋白（histone,H2B）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型（WA）。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3-556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。     

滇重楼辣椒轻斑驳病毒分离物的鉴定及全基因组序列分析

滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)是多年生草本植物,其药用部位为地下根茎,是一种重要的中药材。为明确侵染滇重楼的病毒病原,对采自云南省曲靖市的滇重楼进行透射电镜观察、DASELISA和RT-PCR技术检测。在透射电镜下观察到杆状病毒粒子,大小为(200～300)nm×(20～36)nm。对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测,结果表明,其中5份病样呈阳性。通过RT-PCR技术扩增、克隆获得1个全长为6 357 bp的曲靖分离物PMMoV-QJ的全基因组序列。将PMMoV-QJ的全基因组序列与国内外已经报道的10个PMMoV分离物进行同源性分析比对,其同源性为99.42%～99.81%。基于全基因序列的系统发育分析表明,PMMoV-QJ与韩国分离物亲缘关系密切。本研究明确了该分离物的亲缘关系,从分子水平鉴定该分离物,为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。     

昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的鉴定与提纯及高效价抗血清的制备

对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定（ELISA）和电子显微镜技术（IEM）检测,直径大约28nm,经TAS-ELISA测定仅与CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus ,CarMV）的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化,将提纯后的CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体,间接ELISA测定为1：10240。     

甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)O株系中国分离物(SPFMV-O-Ch1)和RC株系中国分离物(SPFMV-RC-Ch1)的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10 922和10 851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10 557和10 482 nt组成,编码一个多聚蛋白,分别由3 518和3 493个氨基酸残基组成。两个分离物均在P1蛋白内编码一个P1N-PISPO蛋白,在P3蛋白内编码一个P3N-PIPO蛋白。基因组全序列核苷酸一致性分析表明,SPFMV-O-Ch1与SPFMV-RC-Ch1的一致性为87.3%,与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为86.0%—95.8%,与Ruk73分离物的一致性最高,为95.8%,与11-1分离物的一致性最低,为86.0%。SPFMV-RC-Ch1与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为85.9%—98.7%,与IS90分离物的一致性最高,为98.7%,与Aus1-2B分离物的一致性最低,为85.9%。基于多聚蛋白基因核苷酸序列的遗传进化树分析表明,SPFMV-O-Ch1与Ordinary、10-O和17-O等O株系的分离物形成一个分支,SPFMV-RC-Ch1与S、IS90和CW137等RC株系的分离物形成一个分支。重组分析结果表明,O-Ch1分离物中发现3个重组事件,分别发生在7 731—9 710、135—10 012和4 825—6 948 nt,RC-Ch1没有发现重组事件。【结论】我国的SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分离物的基因组结构与其他分离物相同,O-Ch1与O株系分离物一致性较高,RC-Ch1与RC株系分离物一致性较高,O-Ch1分离物检测到3个重组事件,RC-Ch1未发现重组事件。     

甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

杭州郊区马铃薯A病毒分离物的基因组3''-末端序列测定及系统进化分析

采用马铃薯A病毒属通用引物Sprimer扩谱了引起浙江杭州郊区发生的马铃薯病毒基因组3'-末端1687核苷酸序列,它包括MIb,CP和3'-UTR,3'-末端含Poly(A)尾,蚜传基序DAG位于多聚蛋白第215－217氨基酸。BLAST分析表明该病毒为马铃薯A病毒（PVA）,它与已报道的19个PVA分离物CP氨基酸进行比较,PVA浙江分离物与荷兰Alc分离物同源性最高,为99．6％。系统进化树分析表明,PVA分离物间存在一些明显的进化群体。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定

采用RT-PCR方法,扩增并测定了黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物(CGMMV-GD-GZ,CGMMV-GD-LZ,CGMMV-GD-LF)的外壳蛋白(coat protein,CP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因序列。结果显示,CP基因序列全长486 bp,编码161个氨基酸;MP基因全长795 bp,编码264个氨基酸。CGMMV广东分离物与其他15个CGMMV分离物之间外壳蛋白基因核苷酸的同源性在90.9%～100%之间,运动蛋白核苷酸同源性为92.7%～100%;与同属其他13种病毒基因组核苷酸序列同源性分别仅为29.5%～56.2%和38.8%～61.8%。基于外壳蛋白和运动蛋白基因序列构建系统发育树显示,CGMMV不同分离物进化为亚洲和欧洲两大群体,3种CGMMV广东分离物与韩国、日本等亚洲分离物同源性极高,可能具有共同的侵染源。     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析及其分组

为了揭示黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)河北分离物分子变异及系统进化情况。本研究自河北省5个代表性西瓜产区采集病样,分离纯化获得5个CGMMV河北分离物,经RTPCR扩增、基因克隆获各分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列。使用Vector NTI 10.0软件(Informax,Frederick,MD,USA)和MEGA5.0软件(Koichiro,Tokyo,Japan)对河北省5个分离物及GenBank已登录其它分离物CP进行序列分析,构建系统发育树。系统进化关系分析表明:所有CGMMV分离物可划分为5个组,CGMMV河北分离物与中、日、韩三国分离物亲缘关系较近,位于同一组别。与希腊2个分离物(CGMMV-GR5、GR3)亲缘关系最远。CGMMV CP序列相似性分析结果表明:河北省5个分离物CP核苷酸、氨基酸序列相似性在99%~100%之间,与其它17个分离物序列相似性在92%~100%之间。与中国LN及Liaoning两个分离物及韩国Watermelon分离物相似性最高为100%,与希腊2个分离物(GR5、GR3)序列相似性最低为92%~99%。揭示了CGMMV河北分离物的分类地位及其与不同来源分离物之间的遗传进化关系,为进一步研究CGMMV株系划分、基因遗传变异提供了理论基础。     

4株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及其全基因组序列分析

为探讨4株鸽源Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type1,PPMV-1)分离株的遗传起源和基因Ⅵ型PPMV-1全基因组氨基酸序列特征性的变化,对江苏省2007—2008年临床发病鸽中分离鉴定出的4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行全基因组序列分析比对。结果表明,分离的4株PPMV-1分离株均属于Ⅵb型,且与欧洲流行株EU/re亚型遗传距离最近,而与中国流行株遗传距离较远;氨基酸序列分析发现,在核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、大分子蛋白(L)中分别有1个基因Ⅵ型PPMV-1序列特征的氨基酸突变。     

辣椒脉斑驳病毒湖南分离物全基因组序列测定及分子特征

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是东南亚茄科作物主产地主要病毒种类之一,严重危害辣椒等茄科作物的生产。测定ChiVMV的全基因组序列,分析其分子特征,可以明确该病毒的适应性进化以及对我国辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学基础。【方法】以湖南疑似感染ChiVMV辣椒为样本,采用small RNA高通量测序结合RT-PCR测定病毒全基因组序列,利用Mega、RDP及DnaSP等生物学软件分析其分子特征。【结果】ChiVMV湖南分离物全长基因组序列为9 704 nt(不包含3′-A尾),与其他分离物的序列同源性为84%～94%。系统发育分析表明,我国的ChiVMV聚类为一个亚簇,与其他国家和地区分离物不存在重组事件。基因的替换指数R=3.29,替换碱基类型主要是C/T替换。【结论】碱基替换突变可能是ChiVMV湖南分离物适应性进化的主要因素。