非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p54间接ELISA抗体检测方法的建立及试剂盒研制

非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病,目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一,参与病毒的吸附和侵入,是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原,建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法,优化了检测条件,组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测,确定了本试剂盒检测的临界值,并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示,本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍,与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应;试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2～8℃贮存9个月,特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明,本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性,与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率,为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法，本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体，采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清，通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示，该方法的临界值为25.62%时，ROC的曲线面积最大，为0.9989，诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清，结果显示，除ASFV阳性血清外，其他阳性血清均为阴性，表明特异性强；利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4～1∶2 048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测，结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致，敏感性高。利用该方法对3份灭活的...     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较试验

目前国内外的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒种类繁多,为了给实际使用提供参考依据,用猪瘟病毒阴性、弱阳性、强阳性血清参考品为标尺,比较了14种国内外猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的符合率。结果表明,6种阻断ELISA试剂盒符合率均可达到100%,在敏感性和特异性上整体优于间接ELISA试剂盒。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温...     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区高效表达及间接ELISA抗体检测方法的建立和应用

利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区,建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法。依据大肠杆菌密码子偏好性对猪瘟病毒E2基因主要抗原区的稀有密码子进行同义替换,克隆至pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组表达菌,并将纯化重组蛋白作为抗原建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的方法。对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示获得分子量为30 ku的重组蛋白,占细菌总蛋白的41%,与猪瘟抗体特异性反应强;间接ELISA重复性检测显示批内变异系数为3.72%,批间变异系数为4.75%;特异性检测显示,与猪圆环病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒和口蹄疫病毒的抗体阳性血清无交叉反应,并且对566份样品的临床检测结果显示与爱德仕猪瘟阻断ELISA试剂盒的阳性符合率为90.80%,阴性符合率为93.29%,总符合率为91.52%。结果表明密码子优化后E2重组蛋白实现高效表达,建立的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法成本低、准确率高,可进一步开发应用。     

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。     

应用猪圆环病毒2型缺失NLS的Cap蛋白建立一种ELISA检测方法

本试验通过诱导重组质粒pCold-SUMO-dCap在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性表达的SUMO-dCap融合蛋白,以SUMO-dCap融合蛋白作为包被抗原,建立了一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA方法。用该方法与商品化试剂盒对267份猪血清进行平行检测,两种方法的符合率为90.26%,该方法的特异性和灵敏性分别为93.33%、97.16%;与猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒和猪瘟病毒阳性参考血清无交叉反应;批内和批间变异系数分别为1.25%⁶.37%和6.68%6.37%和6.68%¹3.58%。研究结果表明,本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性好、重复性高,为临床上PCV2血清抗体检测和PCV2流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法,为商品化试剂盒开发奠定了良好的基础。     

流行性出血病病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制

为研制流行性出血病病毒（epidemic hemorrhagic disease virus，EHDV）ELISA 抗体检测试剂盒，用饱和硫酸铵浓缩EHDV灭活病毒作为包被抗原，以EHDV鼠源单克隆抗体作为阻断抗体，商品化的IgG-HRP羊抗鼠二抗作为检测抗体，通过优化检测试剂中各组分含量和反应程序，建立了一种EHDV阻断ELISA抗体检测方法。用研制的试剂盒与ID Screen参考试剂盒分别检测实验室保存的血清样本，结果发现该方法的特异性、敏感性与ID Screen参考试剂盒一致，二者符合率为97.00%。结果表明，研制的EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒可作为EHDV抗体检测的候选试剂盒，代替国外试剂盒使用，从而降低EHDV检测成本，这对该病防控具有重要意义。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学检测方法,本研究根据ASFV Georgia2007/1株基因组合成其p72全长基因,并将其克隆至p GEX6p-1载体,构建重组质粒pGEX6p-1-p72并经酶切、PCR和测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示获得了可溶性表达且纯度较高的重组p72蛋白(rp72)。利用GST亲和纯化层析柱纯化,得到浓度为0.2 mg/mL的rp72。以rp72作为包被抗原,通过优化各反应条件建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,结果显示,rp72最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭时间为37℃1 h;待检血清稀释度为1.100,孵育时间为37℃30 min;羊抗猪IgG-HRP孵育时间为37℃1 h。利用该方法检测280份阴性血清,确定其临界值为0.412。采用建立的间接ELISA抗体方法对PEDV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV、PPV、PCV、E. coli阳性猪血清进行检测,结果显示,除ASFV阳性对照为阳性外,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,该方法特异性强;将非洲猪瘟抗体阳性猪血清2倍倍比稀释(1.100～1.6 400)后,利用该方法进行检测,结果显示其检测阳性血清的稀释度为1.3 200倍时OD_(450nm)值仍大于临界值,敏感性高于市售西班牙ASFV阻断ELISA试剂盒检测结果,本研究建立的方法敏感性较高;对该方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间的变异系数均10%,重复性良好。利用本研究建立的ASFV ELISA抗体检测方法(p72)对184份临床血清进行检测,结果显示该方法敏感性为100%,特异性为98.70%;与ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒方法总符合率为98.91%,kappa值为0.961。本研究首次基于rp72建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为ASFV抗体检测提供了一种快速、精准、经济、高效的方法。     

采用不同ELISA试剂盒对猪瘟抗体水平调查结果的影响

本文采用猪瘟抗体间接ELISA和阻断ELISA检测试剂盒对320份血清样本进行猪瘟抗体检测,符合率达80.63%,对检测结果不一致的样品,利用抗体中和试验(FVNT)做定性检测,结果表明,间接ELISA试剂盒的敏感性和特异性均高于阻断ELISA试剂盒,猪瘟间接ELISA试剂盒更适用于我国猪瘟抗体检测。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20 ℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。     

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明¹⁴⁶PAEPYTT¹⁵²为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL^-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。     

猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的临床应用研究

采用猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒对5省/市的猪血清样本进行检测,并与进口ELISA试剂盒相比较,同时采用世界动物卫生组织(OIE)指定方法-荧光抗体病毒中和试验对检测结果有差异的血清样本进行验证,结果显示,两种试剂盒对田间临床样本的符合率为78.1%;猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒与荧光抗体病毒中和试验的符合率高于进口ELISA试剂盒;综合免疫背景分析,猪瘟病毒间接ELISA抗体试剂盒的敏感性和特异性均高于进口试剂盒,更适合在我国进行大规模推广应用。     

猪瘟病毒中和性单克隆抗体制备及阻断ELISA方法建立

采用毕赤酵母表达的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠，经间接免疫荧光(IFA)筛选，获得了17株特异性单抗。经病毒中和试验(VNT)验证，上述单抗均具有CSFV中和活性，其中单克隆抗体3H9的病毒中和效价最高，大于1∶10 240。采用HRP标记的CSFV单抗3H9为阻断抗体，配合酵母表达的CSFV E2蛋白作为包被抗原，建立了一种用于检测猪血清中CSFV中和抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后的抗原包被浓度为0.5μg/mL,阻断抗体稀释度为1∶8 000。通过对100份阴性猪血清的检测，确定该方法的阻断率cut-off值为30%。该方法敏感性高，对中和抗体效价低至1∶16的血清检测仍呈阳性；特异性强，仅与CSFV抗体阳性猪血清呈阳性反应，与其他猪病病毒及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体阳性猪血清均呈阴性反应；良好的可重复性，批内、批间变异系数分别为0.90%～3.21%、1.89%～6.57%,均小于10%。对188份现有猪血清检测结果显示，该方法与病毒中和试验和IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合率分别为96.3%、94.7%。用该方法对南京市浦口区某养殖场...     

猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保存期测定。结果显示,其敏感性高,特异性强,批内批间重复性好,与商品化试剂盒符合率高,保存期长且性质相对稳定。先后制备了5个批次的阻断ELISA试剂盒,用于检测PCV2不同疫苗免疫猪血清、规模猪场PMWS发病猪及同群健康猪血清、不同日龄猪群血清.结果显示,PCV2油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高,PWMS发病猪血清抗体水平高于同群健康猪,猪群中育肥猪血清抗体水平最高。     

乙型脑炎病毒EⅢ基因片段的表达与EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒,将乙型脑炎病毒EⅢ基因克隆至原核表达载体p ET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。以纯化后的重组蛋白EⅢ包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western bloting分析表明,重组蛋白分子质量约为30ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有来良好的免疫原性。优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为4.7μg/m L,血清样本的阳性临界值为0.255。特异性试验结果表明,重组蛋白与猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环病等多种病原体的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明,血清稀释至1∶6400时仍检测为阳性。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%。用该试剂盒检测224份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为90.7%。研究结果表明,原核表达的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ蛋白具有良好的免疫原性,研制的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,为猪流行性乙型脑炎的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别等方面提供了重要方法。     

检测猪瘟病毒E0抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

应用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒的E0基因片段,并将其分别克隆到pGEX-4T-1与pET-28a载体,获得了pGEX-4T-1-E0与pET-28a-E0重组表达质粒。以IPTG诱导表达的纯化GST-E0和His-E0重组蛋白为包被抗原,建立检测猪瘟病毒E0抗体的间接ELISA方法。采用方阵滴定法,确定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分别为50 ng/孔和100 ng/孔,血清最佳稀释度为160倍。对80份猪瘟阴性血清样品进行了检测与统计学分析,确定出GST-E0和His-E0重组蛋白的间接ELISA方法的临界值分别为0.167和0.176。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,本试验建立的基于GST-E0和His-E0蛋白的间接ELISA方法均具有特异、敏感和重复性好等优点。应用GST-E0和His-E0的间接ELISA方法及IDEXX E2抗体检测试剂盒平行检测88份猪血清样品,结果显示基于GST-E0和His-E0的间接ELISA方法与IDEXX试剂盒的符合率分别为78.41%和84.09%。以猪瘟病毒接毒细胞为抗原,应用免疫荧光试验(IFA)对His-E0间接ELISA和IDEXX检测试剂盒检出的阴性与阳性血清样品进行了验证,结果IFA与His-E0间接ELISA方法的符合率为93.18%;IFA与IDEXX试剂盒的符合率为90.91%,表明本试验所建立的基于His-E0的间接ELISA方法用于检测猪瘟抗体优于IDEXX公司检测E2抗体的试剂盒。该方法为鉴别E2亚单位疫苗免疫后的猪群中是否存在野毒感染提供了技术手段。